JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

Abstract

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכנים ברקמה של מערכת העצבים המרכזית (CNS), המבצעים פונקציות רבות התומכות בבריאות העצבית והומאוסטזיס CNS. הם אוכלוסייה עיקרית של תאי חיסון הקשורים לפעילות מחלת CNS, ומאמצים פנוטיפים תגובתיים שעלולים לתרום לפגיעה עצבית במהלך מחלות נוירודגנרטיביות כרוניות כגון טרשת נפוצה (MS). המנגנונים הייחודיים שבאמצעותם תאי מיקרוגליה מווסתים את התפקוד העצבי ואת הישרדותו במהלך בריאות ומחלות נותרו מוגבלים עקב אתגרים בפתרון האינטראקציות המורכבות in vivo בין מיקרוגליה, נוירונים וגורמים סביבתיים אחרים במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, גישת ה-in vitro של תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים נותרה כלי רב ערך לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה ולתרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מעכברים. באופן ספציפי, תאי מיקרוגליה בודדו לאחר 9-10 ימים במבחנה מתרבית גליה מעורבת שהוקמה מהומוגנטים במוח שמקורם בעכברים ילודים בין הימים שלאחר הלידה 0-2. תאי עצב בודדו מקליפות המוח של עוברי עכברים בין הימים 16-18. לאחר 4-5 ימים במבחנה, תאי עצב נזרעו בצלחות 96 באר, ולאחר מכן תוספת של מיקרוגליה כדי ליצור את התרבות המשותפת. תזמון זהיר הוא קריטי עבור פרוטוקול זה מכיוון ששני סוגי התאים צריכים להגיע לבשלות ניסויית כדי לבסס את התרבית המשותפת. בסך הכל, תרבית משותפת זו יכולה להיות שימושית לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון ויכולה לספק קריאות מרובות, כולל מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, הדמיה חיה, כמו גם בדיקות RNA וחלבונים.

Introduction

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכני רקמות המאפשרים מעקב חיסוני והומאוסטזיס במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2,3. מקורם בתאי אב אריתרומיאלואידים של שק החלמון המאכלסים את המוח במהלך ההתפתחות העוברית 4,5,6 ונשמרים לאורך כל חיי האורגניזם באמצעות התחדשות עצמית, הכוללת התרבות ואפופטוזיס7. במצב יציב, תאי מיקרוגליה במנוחה הם בעלי מורפולוגיה מוגברת ועוסקים במעקב רקמות 8,9,10.

מיקרוגליה מבטאת קולטנים רבים לפני השטח של התא, מה שמאפשר להם להגיב במהירות לשינויים במערכת העצבים המרכזית11,12 ולקדם תגובות דלקתיות במקרה של זיהומים או פגיעה ברקמות 12,13,14, כמו גם במהלך מחלות נוירודגנרטיביות 9,15, כגון טרשת נפוצה (MS)16,17. מיקרוגליה גם מבטאת קולטנים למוליכים עצביים שונים ולנוירופפטידים 18,19,20, מה שמרמז שהם עשויים גם להגיב ולווסת את הפעילות העצבית 21,22. ואכן, מיקרוגליה ונוירונים מתקשרים בצורות שונות של תקשורת דו-כיוונית 8,23 כגון אינטראקציות ישירות בתיווך חלבוני ממברנה או אינטראקציות עקיפות באמצעות גורמים מסיסים או תאי ביניים23,24.

לדוגמה, מוליכים עצביים שונים המופרשים על ידי נוירונים יכולים לווסת את הפעילות הנוירופרוטקטיבית או הדלקתית של מיקרוגליה 25,26,27. בנוסף, אינטראקציות ישירות בין נוירונים למיקרוגליה עוזרות לשמור על תאי מיקרוגליה במצב הומיאוסטטי28. לעומת זאת, אינטראקציות ישירות של מיקרוגליה עם נוירונים יכולות לעצב מעגלים עצביים29 ולהשפיע על איתות עצבי 30,31,32. מכיוון שהפרעות באינטראקציות אלה גורמות להתרגשות יתר של נוירונים30 ותגובתיות מיקרוגליה 33,34, אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מווסתות מעורבות כגורם תורם למחלות נוירולוגיות33,35. ואכן, מחלות פסיכוטיות23,26 ומחלות נוירודגנרטיביות תוארו כמציגות אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מתפקדות33. בעוד שתצפיות אלה מדגישות את החשיבות של תקשורת מיקרוגליה-עצבית במערכת העצבים המרכזית, מנגנונים ספציפיים של האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות תפקודים מיקרוגליאליים ועצביים בבריאות ובמחלות אינם ידועים יחסית.

בסביבה מורכבת כמו מערכת העצבים המרכזית, גורמים סביבתיים מרובים יכולים להשפיע על אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות תאיות חולפות in vivo. במאמר זה אנו מציגים מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציות תאיות ישירות בין תאי מיקרוגליה לתאי עצב. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מקליפת המוח של עכברים ילודים בין ימים 0-2 לאחר הלידה לבין ימים 16-18 של עכברים עובריים, בהתאמה. תאי עצב ותאי מיקרוגליה מתורבתים במשותף בלוחות של 96 בארות לצורך ניסויים במורד הזרם, בעלי תפוקה גבוהה. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי להדגים כי פגוציטוזה של מיקרוגליה מגנה על תאי עצב מפני מוות תאי מתווך של פוספטידילכולין מחומצן37, מה שמרמז על כך ששיטה זו יכולה לסייע בהבנת תפקידי תאי מיקרוגליה בהקשר של ניוון עצבי וטרשת נפוצה. באופן דומה, תרביות מיקרו-נוירונים עשויות להיות שימושיות גם לחקר ההשפעה של דיבור צולב מיקרוגליה-עצבי בהקשרים אחרים כגון זיהומים ויראליים38 או פגיעה עצבית ותיקון39. בסך הכל, מערכות תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה מאפשרות לחוקרים לחקור אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים בסביבה מניפולטיבית ומבוקרת, אשר משלימה מודלים in vivo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה שוכנו וטופלו באישור הוועדה האוניברסיטאית לטיפול בבעלי חיים (UACC) של אוניברסיטת ססקצ'ואן והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). ימים לאחר הלידה 0-2 CD1 עכברים ונקבות זכר ונקבה וימים עובריים 16-18 (E16-18) עוברים מעכברות CD1 בהריון שימשו למחקר זה. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. תרבית מיקרוגליה ראשונית

הערה: חיוני לתזמן את תרביות הגליה והנוירונים המעורבים, כך שתאי מיקרוגליה יהיו בשלים ומוכנים לקציר תוך יומיים לאחר שתאי עצב נזרעים לתוך צלחת של 96 בארות.

  1. הכנה
    1. מדיה טרום חמה מלאה של תרבית גליה, הכוללת את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז גבוה בתוספת סרום בקר עוברי 10% מומת בחום, 50 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין עם 2.92 מ"ג/מ"ל L-גלוטמין, 1mM נתרן פירובט, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, ו-20 mM של HEPES באמבט מים של 37°C.
    2. הוסף 5 מ"ל של 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-אורניתין (PO) הידרוברומיד לכל בקבוק T-75. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח שנקודת המכירה תכסה לחלוטין את תחתית הצלוחית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2 למשך שעה אחת לפחות.
      הערה: שלב ציפוי זה נדרש כדי להקל על הידבקות התאים לצלוחיות T-75.
  2. בידוד מוחות מעכברי יילודים P0-P2
    הערה: לעקר את כל כלי הדיסקציה ולשמור על סטריליות של ריאגנטים. הקפידו על טכניקות אספטיות לאורך כל הדרך.
    1. לפני תחילת הנתיחה, רססו את משטח העבודה באתנול 70% או תרסיס חיטוי שבו תתבצע הנתיחה. הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה והניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. יוצקים 20 מ"ל של מדיה L-15 של לייבוביץ' לתוך צלחת פטרי. יש להשאיר את מכסה צלחת הפטרי דולק בזמן שהמיקרוסקופ אינו בשימוש כדי להפחית את הזיהום.
    2. הניחו כמה שכבות של מגבת נייר ורססו היטב את מגבות הנייר באתנול 70%. הכינו את כלי הדיסקציה (מספריים לנתיחה, זוג מיקרו-מלקחיים ומלקחיים רקמות) על ידי ריסוס יסודי שלהם באתנול 70% והנחת הכלים על מגבות הנייר.
    3. העבירו את העכבר בימים שלאחר הלידה 0-2 עכברים על מגבות הנייר ורססו היטב את העכבר באתנול 70%. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים לדיסקציה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו באופן מוסדי).
    4. תוך כדי אחיזה עדינה של הראש, צרו חתך בקו האמצע בגולגולת החל מהצוואר ועד האף. לקלף את הגולגולת בחזרה עם מלקחיים רקמות כדי לחשוף את המוח.
    5. באמצעות מלקחיים רקמתיים, גרפו בעדינות את המוח החוצה על ידי החדרת המלקחיים מתחת למוח והרימו את המוח החוצה מהראש. הכניסו מיד את המוח לצלחת פטרי המכילה 20 מ"ל של מדיית L-15 של לייבוביץ'.
    6. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, להסיר בזהירות את גזע המוח ואת קרומי המוח באמצעות זוג מיקרו-מלקחיים. אספו את המוחות בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיית L-15 של לייבוביץ'.
  3. דיסוציאציה מוחית, זריעה ושמירה על תרבית גליה מעורבת
    הערה: בצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית.
    1. טוחנים את המוח לכ-1 מ"מ2 חתיכות בעזרת להב אזמל חד פעמי סטרילי. בזהירות להעביר את המוח טחון לתוך צינור סטרילי חדש 50 מ"ל.
    2. למוח הטחון, הוסף ריכוז סופי של 0.25% טריפסין ודגור על הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כל 2-3 דקות, מערבבים את התמיסה על ידי היפוך עדין של הצינור כדי לסייע לדיסוציאציה של הרקמות.
    3. מאינקובטור 5% CO2 , העבירו את צלוחיות T-75 המכילות 5 מ"ל PO לארון הבטיחות הביולוגית. יש להשליך את ה-PO ולשטוף את הצלוחיות 3 פעמים בתמיסת חיץ פוספט סטרילית 1x (PBS). הקפידו לשטוף היטב את הצלוחיות מכיוון שעודף PO רעיל לתאים.
    4. העבירו את הרקמה המעוכלת מאמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לארון הבטיחות הביולוגית. הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה של תרבית גליה כדי לנטרל את הטריפסין. מערבבים בעדינות את מתלה הרקמה באמצעות פיפטה 10 מ"ל.
    5. מניחים מסננת סטרילית של תאי רשת ניילון 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והרטיבו את הרשת על ידי שפיכה של כ-5 מ"ל L-15. מרוקנים בזהירות את תרחיף התא דרך מסננת התא. הסר את הבוכנה מזרק סטרילי 1 מ"ל, לטחון את הרקמה לתוך הרשת באמצעות הבוכנה כדי להיפטר גושי רקמות, וליצור השעיה תא הומוגני.
    6. מעת לעת, יוצקים כ 5 מ"ל של מדיה L-15 של לייבוביץ לתוך רשת ניילון 70 מיקרומטר ולהמשיך לטחון את הרקמה על הרשת עם בוכנה מזרק 1 מ"ל. כאשר נשארת מעט רקמה נראית לעין על הרשת, השליכו את הרשת והניחו את מתלה התא בצד.
    7. ערבבו את מתלה התא על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. לכל צלוחיות יש להוסיף נפחים שווים של תרחיף תאים המכיל 1-2 מוחות עם תרבית גליה לנפח סופי של 15 מ"ל.
    8. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 של 5% למשך הלילה. למחרת, שטפו את הצלוחיות פעמיים עם PBS סטרילי 1x כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך.
    9. הוסף 15 מ"ל של מדיה תרבית גליה מלאה טרייה לתרבית ודגרה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 . לאחר 3 ימים, יש להחליף מחצית מהמדיה ב-10 מ"ל של תרבית גליה טרייה בתוספת 40 ננוגרם/מ"ל של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (MCSF).
      הערה: לאחר מכן, מחצית המדיה מוחלפת ב-10 מ"ל של תרבית גליה טרייה בתוספת 40 ננוגרם/מ"ל של MCSF כל 3 ימים. התרבית נשמרת במשך 8-10 ימים לפני קציר מיקרוגליה.

2. תרבית נוירונים ראשונית

  1. הכנה
    1. להפשיר B-27 בתוספת תוספת מ B-27 בתוספת מערכת התרבית העצבית. טרום חום נוירובזאלי פלוס בינוני מ B-27 בתוספת מערכת התרבית העצבית, 1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), וסרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ב 37 ° C באמבט מים.
    2. מעיל T-25 צלוחיות עם 5 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל PO לדגור את הצלוחיות לפחות 1 שעה ב 37 ° C. הכינו מכשירים וציוד לנתיחה.
      הערה: שלב ציפוי זה מקל על הידבקות התאים לצלוחיות T-25.
  2. בידוד מוחי מעוברי עכברים E16-E18
    הערה: לעקר את כל כלי הדיסקציה ולשמור על סטריליות של ריאגנטים. הקפידו על טכניקות אספטיות לאורך כל הדרך.
    1. לפני תחילת הנתיחה, רססו את משטח העבודה באתנול 70% או תרסיס חיטוי שבו תתבצע הנתיחה. הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה והניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. יוצקים 20 מ"ל של 1x HBSS לתוך צלחת פטרי. יש להשאיר את מכסה צלחת הפטרי דולק בזמן שהמיקרוסקופ אינו בשימוש כדי להפחית את הזיהום.
    2. הניחו כמה שכבות של מגבת נייר ורססו היטב את מגבות הנייר באתנול 70%. הכינו את כלי הדיסקציה (מספריים קפיציים, זוג מיקרו-מלקחיים ומלקחיים רקמות) על ידי ריסוס יסודי שלהם באתנול 70% והנחת הכלים על מגבות הנייר.
    3. יש להרדים עכברה בהריון בין ימי ההיריון 16-18 באמצעות איזופלורן ולהרדים את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד).
    4. הניחו את העכבר על גבו על פיסת מגבת נייר ספוגה באתנול 70%. יש לחטא את אזור הבטן באתנול 70%. הרימו את עור הבטן התחתונה בעזרת מלקחיים רקמתיים ובצעו חתך בצורת V מנקודה זו לכלוב הצלעות התחתונות עם מספריים לדיסקציה.
    5. לתפוס את קרני הרחם המכילות את העוברים עם מלקחיים רקמות בעדינות להסיר את העוברים מחלל הבטן. לחטא בקצרה את קרני הרחם המכילות עוברים עם 70% אתנול.
    6. יש לנתח עובר אחד מהשק הבודד שלו בכל פעם. בעזרת מספריים קפיציים, יוצרים חתך בקו האמצע בחלק העליון של הגולגולת, החל מהחלק האחורי של הצוואר ועד האף. לאחר מכן, הרימו את הגולגולת מאתר החתך כדי לחשוף את המוח. גרפו בעדינות את המוח בעזרת מלקחיים והעבירו את המוח לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה 15 מ"ל של HBSS אחד.
    7. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את גזע המוח ואת קרומי המוח משני צידי קליפת המוח עם זוג מיקרו-מלקחיים. מעבירים את קליפת המוח לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של HBSS 1x ומניחים על קרח.
  3. דיסוציאציה מוחית וזריעה של נוירונים בקליפת המוח בתרבית תאים
    הערה: בצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית.
    1. טחנו את המוח לכ-1 מ"מ2 חתיכות בצינור החרוטי 50 מ"ל עם להב אזמל חד פעמי סטרילי. העבר את המוח הטחון לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל.
    2. הוסף טריפסין לצינור עם ריכוז סופי של 0.25%. לטבול את הצינור באמבט מים חמים 35-38 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולערבב בעדינות את הצינור כדי הומוגניזציה של הרקמה כל 2-3 דקות.
    3. הוציאו את הצינור מאמבט המים החמים. החזירו בעדינות את תרחיף הרקמה מעלה ומטה כדי לנתק תאים נוספים, ולאחר מכן הוסיפו 0.5 מ"ל של FBS מומת בחום לתרחיף ההומוגני כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. הימנעו מבועות אוויר כדי למזער רעילות לתאי עצב.
    4. הניחו מסננת סטרילית של תאי רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והרטיבו את הרשת על ידי הוספת כ-5 מ"ל של מדיה נוירובזלית. סנן את מתלה התא דרך מסננת תאי רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר. באמצעות בוכנה מזרק 1 מ"ל, לטחון בעדינות את הרקמה לתוך מסננת התא. מעת לעת לשפוך כ 5 מ"ל של 1x HBSS תוך המשך טחינה לשטוף את מסננת התא.
    5. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. במהלך תקופה זו, לדלל B-27 בתוספת תוספת במדיה neurobasal plus לריכוז סופי 1x לשימוש כמדיה נוירובזאלית מלאה.
    6. השליכו את נקודת המכירה בצלוחיות T-25 ושטפו את הצלוחיות שלוש פעמים עם 5 מ"ל של PBS 1x.
    7. בזהירות decant כדי להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה 2-3 מ"ל של מדיה neurobasal שלם. קבע את ריכוז התאים ואת מספר התאים הכולל עם hemocytometer ו trypan כחול. צפו לעד 1.0 x 107 תאים לכל עובר.
    8. צלחת את התאים בצלוחיות T-25 מצופות PO עם כ 2.0 x 107 תאים לכל בקבוק ב 5 מ"ל של מדיה נוירובזלית מלאה. לדגור על תרבית התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .
    9. בצע החלפת חצי מדיה כל 2-3 ימים על ידי החלפת 2.5 מ"ל של מדיה מבקבוק התרבית עם מדיה נוירובזלית מלאה טרייה.

3. תרבות משותפת של נוירונים ראשוניים מיקרוגליה

הערה: כל השלבים הבאים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.

  1. זריעת נוירונים בצלחות 96 בארות
    1. הוסף 100 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל PO לכל באר ודגר על הצלוחיות לפחות 1 שעה ב 37 ° C כדי לצפות את הבארות עם PO. שטפו את הצלחת עם 1x PBS 3 פעמים לפני זריעת התאים ושאפו את כל הנוזלים שנותרו לאחר השטיפה האחרונה.
    2. תאי עצב הגדלים בצלוחיות T-25 נקצרים לתרבית משותפת לאחר 2-5 ימים בתרבית. החלף את המדיה עם 5 מ"ל של תמיסת Versene 1x עם 0.25% טריפסין ו- 1 מ"ג / מ"ל DNase I כדי לנתק נוירונים מהבקבוק. מניחים את הצלוחיות בתוך האינקובטור למשך 5-6 דקות לעיכול ומערבלים בעדינות את הבקבוק כל 2-3 דקות כדי לסייע בניתוק התא.
    3. מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ובודקים אם התאים מנותקים תחת מיקרוסקופ. הוסף 0.5 מ"ל של FBS מומת חום כדי לנטרל את הטריפסין וה- DNase I. העבר תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל של מדיה neurobasal מלאה פעם אחת כדי למקסם נוירונים שנאספו. לאסוף את כל התאים באותו צינור חרוטי 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את גלולת התא ב 2-3 מ"ל של מדיה נוירובזאלית מלאה.
    5. לספור תאים עם hemocytometer ולהוסיף מדיה neurobasal מלאה כדי להשיג ריכוז סופי של 7.5 x 105 נוירונים / מ"ל. זרע 100 μL של תרחיף התא לכל באר בצלחת 96 באר מצופה PO כדי לקבל 7.5 x 104 נוירונים / באר. צפויה תפוקה של 5-6 מיליון נוירונים לכל בקבוק.
    6. לדגור על תאי העצב בצלחת של 96 בארות למשך הלילה. הוסף 100 μL של מדיה נוירובזאלית מלאה לכל באר למחרת.
      הערה: ברגע שתאי עצב מציגים צמיחה מתאימה של תהליך עצבי (בסביבות יום 3-4 לאחר הזריעה בצלחות של 96 באר), הם מוכנים לתרבית משותפת עם מיקרוגליה.
  2. בידוד ותרבות משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים
    1. בין 8-10 ימים של גידול גליה מעורבת, לאסוף מיקרוגליה על ידי שטיפה עדינה של צלוחיות T-75 עם מדיה תרבית גליה בכל בקבוק עם פיפטה 10 מ"ל, ולהעביר את התאים ואת המדיה לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. שטפו שוב את הצלוחיות עם תרבית גליה טרייה בנפח 10 מ"ל כדי לנתק תאי מיקרוגליה נוספים מהצלוחיות ולאסוף את המדיה. צפויה תפוקה של 7.5 x 105 מיקרוגליה לבקבוק.
    2. הוסף 20 מ"ל של מצעי תרבית גליה טריים בתוספת MCSF של 20 ננוגרם/מ"ל לכל בקבוק. ניתן לקצור מיקרוגליה פעם או פעמיים נוספות אם תרבות הגליה המעורבת נשמרת.
    3. צנטריפוגה את אוסף התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר את supernatant בעדינות להשעות את הגלולה ב 2 מ"ל של מדיה neurobasal מלא.
    4. לספור את התאים עם hemocytometer ו trypan כחול. הוסף מדיה נוירובזאלית מלאה לריכוז סופי של 2.5 x 105 תאים / מ"ל.
    5. מצלחת התרבית העצבית של 96 בארות, הסר 100 μL של מדיה נוירובזאלית והוסף 100 μL של 2.5 x 105 תאים / mL תרחיף תאים לזרע 2.5 x 104 מיקרוגליה לכל באר של 7.5 x 104 נוירונים. לדגור על התרבית במשך הלילה ב 37 ° C בחממה 5% CO2 כדי לאפשר מיקרוגליה לשקוע. התרבות המשותפת עשויה לשמש כעת לניסויים במורד הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תרשים זרימה שמראה את השלבים העיקריים של תרבית גליה מעורבת עבור מיקרוגליה מוצג באיור 1A. באופן כללי, תאים דלילים ופסולת תאית מוגזמת צפויים ביום הראשון (איור 1B). ביום ה-4 יש לראות עלייה במספר התאים, במיוחד עם יצירת אסטרוציטים דבקים, כפי שמצוין על-ידי המורפולוגיה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי עצב ראשוניים בעכברים ותאי מיקרוגליה ראשוניים, אשר משמשים לאחר מכן ליצירת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור כיצד אינטראקציות מיקרוגליה ונוירונים מווסתות את בריאותם ותפקודם בתאים. גישה פשוטה ונגישה יחסית זו יכולה לספ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

JP מודה במימון תמיכה ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והמכללה לרפואה של אוניברסיטת ססקצ'ואן. YD מודה בתמיכת מימון מקרן הסטארט-אפ של מכללת ססקצ'ואן לרפואה, מענק התגליות של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2023-03659), מענק MS Canada Catalyst (1019973), מענק הקמת קרן מחקר הבריאות של ססקצ'ואן (6368) ומענק מנהיגי העתיד של קרן Brain Canada בקנדה לחקר המוח. איור 1A, איור 2A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dish Fisher 07-202-011Sterile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401
Dissection microscopeVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 21083027
Macrophage colony stimulating factor Peprotech315-02
Micro-ForcepsRWDF11020-11Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acidsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide SigmaP3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
Spring scissorsRWDS11008-42Autoclaved/Sterile
Surgical bladeFeather08-916-5DSterile
T-25 flasksFisher10-126-9
T-75 flasks Fisher13-680-65
Tissue forcepsCodman30-4218Autoclaved/Sterile
Tissue scissorsRWDS12052-10Autoclaved/Sterile
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2.5%)ThermoFisher Sci15090046
Widefield Immunofluorescence MicroscopeZeiss

References

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved