Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Resumo

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Resumo

A microglia são macrófagos residentes nos tecidos do sistema nervoso central (SNC), desempenhando inúmeras funções que apoiam a saúde neuronal e a homeostase do SNC. Eles são uma importante população de células imunes associadas à atividade da doença do SNC, adotando fenótipos reativos que potencialmente contribuem para a lesão neuronal durante doenças neurodegenerativas crônicas, como a esclerose múltipla (EM). Os mecanismos distintos pelos quais a microglia regula a função neuronal e a sobrevivência durante a saúde e a doença permanecem limitados devido aos desafios na resolução das complexas interações in vivo entre microglia, neurônios e outros fatores ambientais do SNC. Assim, a abordagem in vitro de co-cultura de microglia e neurônios continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar as interações microglia-neuronais. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e co-cultura de micróglia primária e neurônios de camundongos. Especificamente, a microglia foi isolada após 9-10 dias in vitro de uma cultura mista de glia estabelecida a partir de homogeneizados cerebrais derivados de camundongos neonatais entre os dias pós-natais 0-2. As células neuronais foram isoladas do córtex cerebral de embriões de camundongos entre os dias embrionários 16-18. Após 4-5 dias in vitro, as células neuronais foram semeadas em placas de 96 poços, seguidas pela adição de microglia para formar a co-cultura. O tempo cuidadoso é fundamental para este protocolo, pois ambos os tipos de células precisam atingir a maturidade experimental para estabelecer a co-cultura. No geral, essa co-cultura pode ser útil para estudar as interações microglia-neurônio e pode fornecer várias leituras, incluindo microscopia de imunofluorescência, imagens ao vivo, bem como ensaios de RNA e proteínas.

Introdução

A microglia são macrófagos residentes no tecido que facilitam a imunovigilância e a homeostase no sistema nervoso central (SNC)^1,2,3. Originam-se de células progenitoras eritromieloides do saco vitelino que colonizam o cérebro durante o desenvolvimento embrionário ^4,5,6 e são mantidas ao longo da vida do organismo por meio da auto-renovação, que envolve proliferação e apoptose⁷. No estado estacionário, a microglia em repouso tem morfologia ramificada e se envo....

Protocolo

Todos os animais utilizados neste estudo foram alojados e manuseados com a aprovação do Comitê Universitário de Cuidados com Animais (UACC) da Universidade de Saskatchewan e do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Dias pós-natais 0-2 camundongos CD1 machos e fêmeas e embriões embrionários dias 16-18 (E16-18) de camundongos CD1 prenhes foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura primária da microglia

NOTA: É crucial cronometrar as culturas mistas de glia e neuronais para que a mic....

Discussão

Este artigo descreve um protocolo para isolar e cultivar neurônios primários de camundongos e microglia primária, que são posteriormente usados para estabelecer uma co-cultura microglia-neuronal que pode ser usada para estudar como as interações entre microglia e neurônios regulam sua saúde e função celular. Essa abordagem relativamente simples e acessível pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos e resultados funcionais das interações dos neurônios da microglia no SNC.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss