Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Resumo

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Resumo

A microglia são macrófagos residentes nos tecidos do sistema nervoso central (SNC), desempenhando inúmeras funções que apoiam a saúde neuronal e a homeostase do SNC. Eles são uma importante população de células imunes associadas à atividade da doença do SNC, adotando fenótipos reativos que potencialmente contribuem para a lesão neuronal durante doenças neurodegenerativas crônicas, como a esclerose múltipla (EM). Os mecanismos distintos pelos quais a microglia regula a função neuronal e a sobrevivência durante a saúde e a doença permanecem limitados devido aos desafios na resolução das complexas interações in vivo entre microglia, neurônios e outros fatores ambientais do SNC. Assim, a abordagem in vitro de co-cultura de microglia e neurônios continua sendo uma ferramenta valiosa para estudar as interações microglia-neuronais. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e co-cultura de micróglia primária e neurônios de camundongos. Especificamente, a microglia foi isolada após 9-10 dias in vitro de uma cultura mista de glia estabelecida a partir de homogeneizados cerebrais derivados de camundongos neonatais entre os dias pós-natais 0-2. As células neuronais foram isoladas do córtex cerebral de embriões de camundongos entre os dias embrionários 16-18. Após 4-5 dias in vitro, as células neuronais foram semeadas em placas de 96 poços, seguidas pela adição de microglia para formar a co-cultura. O tempo cuidadoso é fundamental para este protocolo, pois ambos os tipos de células precisam atingir a maturidade experimental para estabelecer a co-cultura. No geral, essa co-cultura pode ser útil para estudar as interações microglia-neurônio e pode fornecer várias leituras, incluindo microscopia de imunofluorescência, imagens ao vivo, bem como ensaios de RNA e proteínas.

Introdução

A microglia são macrófagos residentes no tecido que facilitam a imunovigilância e a homeostase no sistema nervoso central (SNC)^1,2,3. Originam-se de células progenitoras eritromieloides do saco vitelino que colonizam o cérebro durante o desenvolvimento embrionário ^4,5,6 e são mantidas ao longo da vida do organismo por meio da auto-renovação, que envolve proliferação e apoptose⁷. No estado estacionário, a microglia em repouso tem morfologia ramificada e se envolve na vigilância tecidual ^8,9,10.

A micróglia expressa numerosos receptores de superfície celular, o que lhes permite responder rapidamente a alterações no SNC^11,12 e promover respostas inflamatórias em caso de infecções ou lesão tecidual 12,13,14, bem como durante doenças neurodegenerativas ^9,15, como a esclerose múltipla (EM)^16,17. A microglia também expressa receptores para vários neurotransmissores e neuropeptídeos ^18,19,20, o que sugere que eles também podem responder e regular a atividade neuronal^21,22. De fato, a microglia e os neurônios interagem em várias formas de comunicação bidirecional ^8,23, como interações diretas mediadas por proteínas de membrana ou interações indiretas por meio de fatores solúveis ou células intermediárias^23,24.

Por exemplo, vários neurotransmissores secretados pelos neurônios podem modular a atividade neuroprotetora ou inflamatória da microglia 25,26,27. Além disso, as interações diretas entre neurônios e microglia ajudam a manter a microglia em um estado homeostático²⁸. Por outro lado, as interações diretas da micróglia com os neurônios podem moldar os circuitos neuronais²⁹ e influenciar a sinalização neuronal 30,31,32. Como as interrupções dessas interações induzem hiperexcitabilidade dos neurônios³⁰ e reatividade da microglia^33,34, as interações microglia-neuronais desreguladas são implicadas como um fator contribuinte para doenças neurológicas^33,35. De fato, doenças psicóticas^23,26 e neurodegenerativas foram descritas como exibindo interações microglia-neuronais disfuncionais³³. Embora essas observações destaquem a importância da comunicação microglia-neuronal no SNC, mecanismos específicos de como essas interações regulam as funções microgliais e neuronais na saúde e na doença são relativamente desconhecidos.

Dentro de um ambiente complexo como o SNC, vários fatores ambientais podem influenciar as interações microglia-neuronal, o que limita a capacidade de estudar interações celulares transitórias in vivo. Aqui, apresentamos um sistema de co-cultura microglia-neuronal in vitro que pode ser usado para estudar interações celulares diretas entre microglia e neurônios. Este protocolo descreve a geração de micróglia primária e neurônios a partir dos córtices de camundongos neonatais entre os dias 0-2 pós-natais e os dias 16-18 de camundongos embrionários, respectivamente. Neurônios e microglia são então co-cultivados em placas de 96 poços para experimentos de alto rendimento a jusante. Anteriormente, usamos essa abordagem para demonstrar que a fagocitose da microglia protege os neurônios da morte celular mediada por fosfatidilcolina oxidada³⁷, sugerindo que esse método pode ajudar a entender os papéis da microglia no contexto da neurodegeneração e da EM. Da mesma forma, as co-culturas microglia-neuronais também podem ser úteis para investigar o impacto da diafonia microglia-neuronal em outros contextos, como infecções virais³⁸ ou lesão e reparo neuronal³⁹. No geral, os sistemas de co-cultura microglia-neuronal in vitro permitem que os pesquisadores estudem as interações microglia-neuronais em um ambiente manipulável e controlado, que complementa os modelos in vivo.

Protocolo

Todos os animais utilizados neste estudo foram alojados e manuseados com a aprovação do Comitê Universitário de Cuidados com Animais (UACC) da Universidade de Saskatchewan e do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Dias pós-natais 0-2 camundongos CD1 machos e fêmeas e embriões embrionários dias 16-18 (E16-18) de camundongos CD1 prenhes foram usados para este estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura primária da microglia

NOTA: É crucial cronometrar as culturas mistas de glia e neuronais para que a microglia esteja madura e pronta para a colheita dentro de 2 dias após os neurônios serem semeados em uma placa de 96 poços.

1. Preparação
   1. Meios de cultura completos pré-aquecidos da glia, que incluem o meio de águia modificado (DMEM) de Dulbecco com glicose alta suplementada com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor, 50 U/mL de penicilina/estreptomicina com 2,92 mg/mL de L-glutamina, 1mM de piruvato de sódio, 1x aminoácidos não essenciais e 20 mM de HEPES em banho-maria a 37 °C.
   2. Adicionar 5 ml de bromidrato de poli-L-ornitina (PO) a 10 μg/ml em cada balão T-75. Rode suavemente o balão para garantir que o PO cobre completamente o fundo do balão. Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} por pelo menos 1 h.
      NOTA: Esta etapa de revestimento é necessária para facilitar a adesão das células aos frascos T-75.
2. Isolamento de cérebros de camundongos neonatais P0-P2
   NOTA: Esterilize todas as ferramentas de dissecação e mantenha a esterilidade dos reagentes. Garanta a adesão às técnicas assépticas em todo o processo.
   1. Antes de iniciar a dissecação, borrife a bancada com etanol 70% ou spray desinfetante onde a dissecação ocorrerá. Configure o microscópio de dissecção e coloque a placa de Petri sob o microscópio. Despeje 20 mL do meio L-15 de Leibovitz na placa de Petri. Mantenha a tampa da placa de Petri colocada enquanto o microscópio não estiver em uso para reduzir a contaminação.
   2. Coloque várias camadas de papel toalha e borrife bem as toalhas de papel com etanol 70%. Prepare as ferramentas de dissecção (tesoura de dissecação, um par de micropinças e pinças de tecido) borrifando-as completamente com etanol a 70% e colocando as ferramentas sobre as toalhas de papel.
   3. Transfira os dias pós-parto 0-2 para as toalhas de papel e borrife bem o camundongo com etanol 70%. Decapite o camundongo usando uma tesoura de dissecção (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   4. Enquanto segura suavemente a cabeça, crie uma incisão na linha média do crânio, começando do pescoço ao nariz. Descasque o crânio com uma pinça de tecido para revelar o cérebro.
   5. Usando uma pinça de tecido, retire suavemente o cérebro inserindo a pinça sob o cérebro e levante o cérebro da cabeça. Coloque imediatamente o cérebro na placa de Petri contendo 20 mL de meio L-15 de Leibovitz.
   6. Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente o tronco cerebral e as meninges usando um par de micropinças. Colete os cérebros em um tubo cônico de 50 mL contendo 5 mL de meio L-15 de Leibovitz.
3. Dissociação cerebral, semeadura e manutenção de cultura de glia mista
   NOTA: Execute todas as etapas subsequentes em um gabinete de biossegurança.
   1. Pique os cérebros em pedaços de aproximadamente 1 mm² com uma lâmina de bisturi descartável estéril. Transfira cuidadosamente os cérebros picados para um novo tubo estéril de 50 mL.
   2. Aos cérebros picados, adicione uma concentração final de tripsina a 0,25% e incube o tecido em banho-maria a 37 °C por 20 min. A cada 2-3 minutos, misture a solução invertendo suavemente o tubo para ajudar na dissociação do tecido.
   3. Da incubadora de CO_{5% 2} , transfira os frascos T-75 contendo 5 mL de PO para a cabine de biossegurança. Descarte o PO e enxágue os frascos 3 vezes com solução tampão fosfato 1x estéril (PBS). Certifique-se de enxaguar bem os frascos, pois o excesso de PO é tóxico para as células.
   4. Transferir o tecido digerido do banho-maria a 37 °C para a cabina de biossegurança. Adicione 5 mL de meios de cultura glia completos para neutralizar a tripsina. Misture suavemente a suspensão de tecido usando uma pipeta de 10 mL.
   5. Coloque um filtro de células de malha de nylon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe a malha despejando cerca de 5 mL de L-15. Transvase cuidadosamente a suspensão celular através do filtro celular. Remova o êmbolo de uma seringa estéril de 1 mL, triture o tecido na malha usando o êmbolo para se livrar dos aglomerados de tecido e gere uma suspensão celular homogeneizada.
   6. Periodicamente, despeje aproximadamente 5 mL do meio L-15 de Leibovitz na malha de náilon de 70 μm e continue triturando o tecido na malha com o êmbolo de seringa de 1 mL. Quando pouco ou nenhum tecido visível permanecer na tela, descarte a malha e deixe a suspensão celular de lado.
   7. Misture a suspensão celular pipetando suavemente para cima e para baixo. Em cada frasco, adicionar volumes iguais de suspensão celular contendo 1-2 cérebros com meios de cultura de glia até um volume final de 15 ml.
   8. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5% durante a noite. No dia seguinte, lave os frascos duas vezes com 1x PBS estéril para remover células soltas e detritos.
   9. Adicione 15 ml de meios de cultura de glia completos frescos à cultura e incube a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%. Após 3 dias, troque metade do meio por 10 mL de meio de cultura de glia fresco suplementado com 40 ng/mL de fator estimulador de colônias de macrófagos (MCSF).
      NOTA: Depois disso, metade do meio é substituído por 10 mL de meio de cultura de glia fresco suplementado com 40 ng/mL de MCSF a cada 3 dias. A cultura é mantida por 8 a 10 dias antes da colheita da micróglia.

2. Cultura de neurônios primários

1. Preparação
   1. Descongele o suplemento B-27 plus do sistema de cultura neuronal B-27 plus. Pré-aqueça o meio neurobasal mais do sistema de cultura neuronal B-27 plus, 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) e soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) a 37 °C em banho-maria.
   2. Cobrir os balões T-25 com 5 ml de 10 μg/ml PO e incubar os balões durante, pelo menos, 1 hora a 37 °C. Prepare instrumentos e suprimentos para dissecação.
      NOTA: Esta etapa de revestimento facilita a adesão da célula aos frascos T-25.
2. Isolamento cerebral de embriões de camundongos E16-E18
   NOTA: Esterilize todas as ferramentas de dissecação e mantenha a esterilidade dos reagentes. Garanta a adesão às técnicas assépticas em todo o processo.
   1. Antes de iniciar a dissecação, borrife a bancada com etanol 70% ou spray desinfetante onde a dissecação ocorrerá. Configure o microscópio de dissecção e coloque a placa de Petri sob o microscópio. Despeje 20 mL de 1x HBSS na placa de Petri. Mantenha a tampa da placa de Petri colocada enquanto o microscópio não estiver em uso para reduzir a contaminação.
   2. Coloque várias camadas de papel toalha e borrife bem as toalhas de papel com etanol 70%. Prepare as ferramentas de dissecção (tesoura de mola, um par de micropinças e pinças de tecido) borrifando-as completamente com etanol a 70% e colocando as ferramentas sobre as toalhas de papel.
   3. Anestesiar um camundongo prenhe entre os dias 16-18 de gestação usando isoflurano e sacrificar o camundongo por luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   4. Coloque o rato de costas em um pedaço de papel toalha embebido em etanol a 70%. Desinfete a área abdominal com etanol 70%. Levante a pele da parte inferior do abdômen com uma pinça de tecido e faça uma incisão em forma de V deste ponto até a caixa torácica inferior com uma tesoura de dissecação.
   5. Pegue os cornos uterinos contendo os embriões com uma pinça de tecido e remova suavemente os embriões da cavidade abdominal. Desinfete brevemente os cornos uterinos contendo embriões com etanol a 70%.
   6. Disseque um embrião de seu saco individual de cada vez. Usando uma tesoura de mola, crie uma incisão na linha média na parte superior do crânio, começando da nuca até o nariz. Em seguida, levante o crânio do local da incisão para revelar o cérebro. Retire suavemente o cérebro com uma pinça de tecido e transfira o cérebro para uma placa de Petri de 10 cm contendo 15 mL de 1x HBSS.
   7. Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente o tronco encefálico e as meninges em ambos os lados dos córtices cerebrais com um par de microfórceps. Transfira os córtices cerebrais para um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de 1x HBSS e coloque no gelo.
3. Dissociação cerebral e semeadura de neurônios corticais em cultura de células
   NOTA: Execute todas as etapas subsequentes em um gabinete de biossegurança.
   1. Pique os cérebros em aproximadamente 1 mm² pedaços no tubo cônico de 50 mL com uma lâmina de bisturi descartável estéril. Transfira os cérebros picados para um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
   2. Adicione tripsina ao tubo com uma concentração final de 0,25%. Mergulhe o tubo em banho-maria a 35-38 °C por 15 min e misture suavemente o tubo para homogeneizar o tecido a cada 2-3 min.
   3. Retire o tubo do banho-maria. Pipete suavemente a suspensão de tecido para cima e para baixo para dissociar ainda mais as células e, em seguida, adicione 0,5 mL de FBS inativado por calor à suspensão homogeneizada para neutralizar a atividade da tripsina. Evite bolhas de ar para minimizar a toxicidade para as células neuronais.
   4. Coloque um filtro de células de malha de náilon estéril de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e molhe a malha adicionando cerca de 5 mL de meio neurobasal. Filtrar a suspensão celular através do filtro de células de malha de nylon de 70 μm. Usando um êmbolo de seringa de 1 mL, triture suavemente o tecido no filtro de células. Despeje periodicamente aproximadamente 5 mL de 1x HBSS enquanto continua a moer para lavar o filtro da célula.
   5. Centrifugar o tubo cónico a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Durante esse período, dilua o suplemento B-27 plus em meio neurobasal plus até 1x a concentração final para usar como meio neurobasal completo.
   6. Descarte o PO nos frascos T-25 e lave os frascos três vezes com 5 mL de 1x PBS.
   7. Transvase cuidadosamente para remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo 2-3 mL de meio neurobasal completo. Determine a concentração celular e o número total de células com um hemocitômetro e azul de tripano. Espere até 1,0 x 10⁷ células por embrião.
   8. Plaquear as células nos frascos T-25 revestidos com PO com aproximadamente 2,0 x 10⁷ células por frasco em 5 ml de meio neurobasal completo. Incubar a cultura de células a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} .
   9. Realize uma meia troca de meio a cada 2-3 dias, substituindo 2,5 mL de meio do frasco de cultura por meio neurobasal completo recém-feito.

3. Co-cultura de neurônios primários e microglia

NOTA: Todas as etapas subsequentes devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança estéril.

1. Semeando neurônios em placas de 96 poços
   1. Adicionar 100 μL de 10 μg/ml PO por alvéolo e incubar os frascos durante, pelo menos, 1 h a 37 °C para revestir os alvéolos com PO. Lave a placa com 1x PBS 3 vezes antes de semear as células e aspire o líquido restante após a última lavagem.
   2. Os neurônios cultivados em frascos T-25 são colhidos para co-cultura após 2-5 dias em cultura. Substitua o meio por 5 mL de 1x solução Versene com 0,25% de tripsina e 1 mg/mL de DNase I para separar os neurônios do frasco. Coloque os frascos dentro da incubadora por 5-6 minutos para digestão e gire suavemente o frasco a cada 2-3 minutos para ajudar no descolamento celular.
   3. Retirar o balão da incubadora e verificar se as células estão separadas ao microscópio. Adicione 0,5 mL de FBS inativado por calor para neutralizar a tripsina e a DNase I. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Lave o frasco com 5 mL de meio neurobasal completo uma vez para maximizar os neurônios coletados. Colete todas as células no mesmo tubo cônico de 15 mL.
   4. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em 2-3 mL de meio neurobasal completo.
   5. Conte as células com um hemocitômetro e adicione meios neurobasais completos para atingir uma concentração final de 7,5 x 10⁵ neurônios / mL. Semear 100 μL da suspensão celular para cada poço na placa de 96 poços revestida com PO para obter 7,5 x 10⁴ neurônios / poço. Espera-se um rendimento de 5-6 milhões de neurônios por frasco.
   6. Incube os neurônios em uma placa de 96 poços durante a noite. Adicione 100 μL de meio neurobasal completo a cada poço no dia seguinte.
      NOTA: Uma vez que os neurônios exibem o crescimento apropriado do processo de neurite (por volta do dia 3-4 após a semeadura em placas de 96 poços), eles estão prontos para co-cultura com a microglia.
2. Isolamento e co-cultura microglia-neuronal
   1. Entre 8 a 10 dias de cultivo de glia mista, colete a microglia lavando suavemente os frascos T-75 com meios de cultura de glia em cada frasco com uma pipeta de 10 mL e transfira as células e os meios para um tubo cônico estéril de 50 mL. Lave os frascos novamente com 10 mL de meio de cultura de glia fresco para separar microglia adicional dos frascos e coletar o meio. Espera-se um rendimento de 7,5 x 10⁵ micróglias por frasco.
   2. Adicionar 20 ml de meios de cultura de glia frescos suplementados com 20 ng/ml de MCSF a cada frasco. A microglia pode ser colhida mais uma ou duas vezes se a cultura mista da glia for mantida.
   3. Centrifugar a recolha de células a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 2 mL de meio neurobasal completo.
   4. Conte as células com um hemocitômetro e azul de tripano. Adicione meios neurobasais completos a uma concentração final de 2,5 x 10⁵ células / mL.
   5. Da placa de cultura neuronal de 96 poços, remova 100 μL de meio neurobasal e adicione 100 μL de suspensão de células 2,5 x 10⁵ células/mL para semear 2,5 x 10⁴ microglia por poço de 7,5 x 10⁴ neurônios. Incubar a cultura durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO_{5% 2} para permitir que a microglia se assente. A co-cultura pode agora ser usada para experimentos a jusante.

Resultados

Um fluxograma mostrando as principais etapas da cultura mista da glia para microglia é mostrado na Figura 1A. No geral, células esparsas e detritos celulares excessivos são esperados no dia 1 (Figura 1B). No dia 4, deve-se observar aumento do número de células, principalmente com a geração de astrócitos aderentes, conforme indicado por sua morfologia alongada (Figura 1C). Algumas micróglias podem ser observadas no topo dos ...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo para isolar e cultivar neurônios primários de camundongos e microglia primária, que são posteriormente usados para estabelecer uma co-cultura microglia-neuronal que pode ser usada para estudar como as interações entre microglia e neurônios regulam sua saúde e função celular. Essa abordagem relativamente simples e acessível pode fornecer insights críticos sobre os mecanismos e resultados funcionais das interações dos neurônios da microglia no SNC.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss