マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

要約

このプロトコルは、胚の日15-16でマウスの胚から単離された初代ニューロン細胞から確立されたミクログリア-ニューロン共培養と、出生後1-2日に新生児マウスの脳から生成された初代ミクログリアを説明しています。

要約

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の組織に常在するマクロファージであり、ニューロンの健康とCNSの恒常性をサポートする多くの機能を果たしています。彼らは、CNS疾患の活動性に関連する免疫細胞の主要な集団であり、多発性硬化症(MS)などの慢性神経変性疾患における神経損傷に寄与する可能性のある反応性表現型を採用しています。ミクログリアが健康および疾患中のニューロン機能と生存を制御する明確なメカニズムは、ミクログリア、ニューロン、およびその他のCNS環境因子との間の複雑な in vivo 相互作用を解決する上での課題のために、依然として限られています。したがって、ミクログリアとニューロンを共培養する in vitro アプローチは、ミクログリアとニューロンの相互作用を研究するための貴重なツールであり続けています。ここでは、マウスから初代ミクログリアとニューロンを作製し、共培養するためのプロトコールを紹介します。具体的には、ミクログリアは、出生後0〜2日の間に新生児マウス由来の脳ホモジネートから確立された混合グリア培養物から in vitro で9〜10日後に単離されました。ニューロン細胞は、胚の16-18日の間にマウス胚の脳皮質から単離された。 in vitroで4〜5日後、ニューロン細胞を96ウェルプレートに播種し、続いてミクログリアを添加して共培養を形成しました。このプロトコルでは、両方の細胞タイプが共培養を確立するために実験的成熟に達する必要があるため、慎重なタイミングが重要です。全体として、この共培養はミクログリアとニューロンの相互作用の研究に有用であり、免疫蛍光顕微鏡法、ライブイメージング、RNAおよびタンパク質アッセイなど、複数の読み出しを提供できます。

概要

ミクログリアは、中枢神経系(CNS^{)における}免疫サーベイランスと恒常性を促進する組織常在性マクロファージです^1,2,3。それらは、^{胚発生中に}脳にコロニーを形成する卵黄嚢赤骨髄前駆細胞に由来し、^4,5,6、^増殖とアポトーシス7を含む自己複製を通じて生物の寿命を通じて維持^{されます。}定常状態では、休止中のミクログリアは形態を分岐させ、組織監視に従事しています^8,9,10。

ミクログリアは多数の細胞表面受容体を発現するため、中枢神経系の変化に迅速に反応し^11,12、感染症や組織損傷^の場合12,13,14、多発性硬化症(MS)などの神経変性疾患^9,15の際に炎症反応を促進することができます^16,17.ミクログリアはまた、さまざまな神経伝達物質や神経ペプチド^18,19,20に対する受容体を発現しており、これはそれらがニューロン活動に応答し調節している可能性を示唆しています^21,22。実際、ミクログリアとニューロンは、膜タンパク質によって媒介される直接的な相互作用や、可溶性因子や中間細胞を介した間接的な相互作用など、さまざまな形態の双方向コミュニケーション^8,23で相互作用します^23,24。

例えば、ニューロンによって分泌される種々の神経伝達物質は、ミクログリアの神経保護活性または炎症活性を調節することができる25,26,27。さらに、ニューロンとミクログリアとの間の直接的な相互作用は、ミクログリアを恒常性状態に維持するのに役立ちます²⁸。逆に、ミクログリアとニューロンとの直接的な相互作用は、ニューロン回路を形成し²⁹、ニューロンシグナル伝達30,31,32に影響を与えることができる。これらの相互作用の破綻がニューロン³⁰およびミクログリア反応^性33,34の過興奮性を誘発するため、調節不全のミクログリア-ニューロン相互作用は神経疾患の寄与因子として関与している^33,35。実際、精神病^23,26および神経変性疾患は、機能不全のミクログリア-ニューロン相互作用³³を示すと説明されている。これらの観察結果は、中枢神経系におけるミクログリアとニューロンのコミュニケーションの重要性を強調していますが、これらの相互作用が健康や疾患におけるミクログリアとニューロンの機能をどのように制御するかについての具体的なメカニズムは比較的わかっていません。

中枢神経系のような複雑な環境では、複数の環境要因がミクログリアとニューロンの相互作用に影響を与える可能性があり、 そのためにin vivoでの一過性の細胞相互作用を研究する能力が制限されます。ここでは、ミクログリアとニューロン間の直接的な細胞相互作用を研究するために使用できる 、in vitro ミクログリア-ニューロン共培養システムを紹介します。このプロトコルは、出生後0〜2日目と胚性マウス16〜18日目の間に、それぞれ新生児マウスの皮質からの初代ミクログリアとニューロンの生成を説明しています。その後、ニューロンとミクログリアを96ウェルプレートで共培養し、ダウンストリームのハイスループット実験を行います。私たちは以前にこのアプローチを使用して、ミクログリアの食作用が酸化ホスファチジルコリンを介した細胞死からニューロンを保護することを実証しました³⁷、この方法が神経変性およびMSの文脈におけるミクログリアの役割を理解するのに役立つことを示唆しています。同様に、ミクログリア-ニューロン共培養は、ウイルス感染³⁸ やニューロンの損傷および修復³⁹などの他の状況におけるミクログリア-ニューロンクロストークの影響を調査するためにも有用であり得る。全体として、 in vitro ミクログリア-ニューロン共培養システムにより、研究者は操作可能で制御された環境でミクログリア-ニューロンの相互作用を研究することができ、 これはin vivo モデルを補完します。

プロトコル

この研究で使用されたすべての動物は、サスカチュワン大学の大学動物管理委員会(UACC)およびカナダ動物管理評議会(CCAC)の承認を得て飼育および取り扱われました。この研究では、妊娠中のCD1マウスの出生後0-2日目のCD1オスとメスのマウスと、妊娠したCD1マウスの胚16-18日目(E16-18)の胚を使用しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 初代ミクログリアの培養

注:ニューロンが96ウェルプレートに播種されてから2日以内にミクログリアが成熟し、収穫の準備が整うように、混合グリアとニューロン培養の時間を計ることが重要です。

1. 準備
   1. 高グルコースを添加したダルベッコ改変鷲培地(DMEM)に10%熱不活化ウシ胎児血清、50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンと2.92 mg/mLのL-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、および20 mMのHEPESを37°Cの水浴で調製した予備温グリア培養培地。
   2. 5 mLの10 μg/mLポリ-L-オルニチン(PO)臭化水素酸塩を各T-75フラスコに加えます。フラスコを静かに回転させて、POがフラスコの底を完全に覆うようにします。5% CO₂ インキュベーターで37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。
      注:このコーティングステップは、T-75フラスコへの細胞接着を促進するために必要です。
2. P0-P2新生児マウスからの脳の単離
   注:すべての解剖ツールを滅菌し、試薬の無菌性を維持します。全体を通して無菌技術の遵守を確保します。
   1. 解剖を開始する前に、70%エタノールまたは解剖が行われる場所でカウンタートップにスプレーします。解剖顕微鏡をセットし、ペトリ皿を顕微鏡の下に置きます。20mLのLeibovitzのL-15培地をペトリ皿に注ぎます。顕微鏡を使用していないときは、汚染を減らすために、ペトリ皿の蓋を閉めたままにしてください。
   2. ペーパータオルを数層に重ね、ペーパータオルに70%エタノールを十分にスプレーします。解剖ツール(解剖ハサミ、マイクロ鉗子、組織鉗子)に70%エタノールを十分に噴霧し、ペーパータオルの上にツールを置いて準備します。
   3. 出生後0〜2日目のマウスをペーパータオルに移し、マウスに70%エタノールを十分にスプレーします。解剖ハサミを使用してマウスの首を切ります(機関が承認したプロトコルに従います)。
   4. 頭を優しく保持しながら、首から鼻に向かって頭蓋骨に正中線切開を作成します。組織鉗子で頭蓋骨の裏側をはがして、脳を露出させます。
   5. 組織鉗子を使用して、鉗子を脳の下に挿入して脳をやさしくすくい取り、脳を頭から持ち上げます。すぐに脳を20mLのLeibovitzのL-15培地が入ったシャーレに入れます。
   6. 解剖顕微鏡で、一対のマイクロ鉗子を使用して脳幹と髄膜を慎重に取り除きます。5mLのLeibovitzのL-15培地が入った50mLの円錐形チューブに脳を集めます。
3. 脳の解離、混合グリア培養の播種と維持
   注意: バイオセーフティキャビネットで後続のすべての手順を実行します。
   1. 脳を滅菌済みの使い捨てメスの刃で約^1mm2 個に刻みます。細かく刻んだ脳を新しい滅菌50mLチューブに慎重に移します。
   2. みじん切りにした脳に最終濃度0.25%のトリプシンを加え、組織を37°Cの水浴で20分間インキュベートします。2〜3分ごとに、チューブを静かに反転させて溶液を混合し、組織の解離を助けます。
   3. 5% CO₂ インキュベーターから、5 mLのPOが入ったT-75フラスコをバイオセーフティキャビネットに移します。POを廃棄し、滅菌済みの1xリン酸緩衝液(PBS)でフラスコを3回すすぎます。過剰なPOは細胞に有毒であるため、フラスコを十分にすすいでください。
   4. 消化した組織を37°Cのウォーターバスからバイオセーフティキャビネットに移します。5 mLの完全グリア培養培地を加えて、トリプシンを中和します。10 mLピペットを使用して組織懸濁液を穏やかに混合します。
   5. 滅菌済みの70 μmナイロンメッシュセルストレーナーを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに置き、約5 mLのL-15を注いでメッシュを濡らします。細胞懸濁液を細胞ストレーナーを通して慎重にデカントします。滅菌済みの1 mLシリンジからプランジャーを取り出し、プランジャーを使用して組織をメッシュに粉砕して組織の塊を取り除き、均質化された細胞懸濁液を生成します。
   6. 定期的に、約5 mLのLeibovitzのL-15培地を70 μmのナイロンメッシュに注ぎ、1 mLのシリンジプランジャーでメッシュ上の組織を粉砕し続けます。メッシュ上に目に見える組織がほとんどまたはまったく残っていない場合は、メッシュを廃棄し、細胞懸濁液を脇に置きます。
   7. 細胞懸濁液を静かにピペッティングして混合します。各フラスコに、1〜2個の脳を含む等量の細胞懸濁液とグリア培養培地を最終容量15mLまで加えます。
   8. 細胞を37°Cで5%_CO2 インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日、フラスコを滅菌済みの1x PBSで2回洗浄し、付着していない細胞や破片を取り除きます。
   9. 15 mLの新鮮完全グリア培養培地を培養物に加え、5% CO₂ インキュベーターで37°Cでインキュベートします。3日後、培地の半分を、40 ng/mLのマクロファージコロニー刺激因子(MCSF)を添加した10 mLの新鮮なグリア培養培地で交換します。
      注:その後、培地の半分を10 mLの新鮮なグリア培養培地に交換し、3日ごとに40 ng / mLのMCSFを補充します。ミクログリアが収穫される前に、培養物は8〜10日間維持されます。

2. 初代ニューロン培養

1. 準備
   1. B-27とB-27からのサプリメントとニューロン培養システムの解凍。B-27と神経細胞培養システム、1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)、および37°Cの水浴中で加熱不活性化されたウシ胎児血清(FBS)の温温性ニューロベースルプラス培地。
   2. T-25フラスコに5 mLの10 μg/mL POをコーティングし、フラスコを37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。 解剖用の器具と消耗品を準備します。
      注:このコーティングステップは、T-25フラスコへの細胞接着を促進します。
2. E16-E18マウス胚からの脳分離
   注:すべての解剖ツールを滅菌し、試薬の無菌性を維持します。全体を通して無菌技術の遵守を確保します。
   1. 解剖を開始する前に、70%エタノールまたは解剖が行われる場所でカウンタートップにスプレーします。解剖顕微鏡をセットし、ペトリ皿を顕微鏡の下に置きます。20mLの1x HBSSをペトリ皿に注ぎます。顕微鏡を使用していないときは、汚染を減らすために、ペトリ皿の蓋を閉めたままにしてください。
   2. ペーパータオルを数層に重ね、ペーパータオルに70%エタノールを十分にスプレーします。解剖ツール(スプリングハサミ、マイクロ鉗子、組織鉗子)に70%エタノールを十分に噴霧し、ペーパータオルの上にツールを置いて準備します。
   3. 妊娠 16 日から 18 日の間にイソフルランを使用して妊娠中のマウスに麻酔をかけ、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます (施設で承認されたプロトコルに従います)。
   4. 70%エタノールに浸したペーパータオルの上にマウスを仰向けに置きます。腹部を70%エタノールで消毒します。組織鉗子で下腹部の皮膚を持ち上げ、この点から解剖ハサミで胸郭下部までV字切開を行います。
   5. 胚を含む子宮角を組織鉗子でつかみ、腹腔から胚をそっと取り出します。胚を含む子宮角を70%エタノールで簡単に消毒します。
   6. 一度に1つの胚をその個々の嚢から解剖します。スプリングハサミを使用して、首の後ろから鼻に向かって、頭蓋骨の上部に正中線切開を作成します。次に、頭蓋骨を切開部位から持ち上げて脳を露出させます。組織鉗子で脳をやさしくすくい取り、15mLの1x HBSSが入った10cmのシャーレに脳を移します。
   7. 解剖顕微鏡下で、一対のマイクロ鉗子で脳幹と脳皮質の両側の髄膜を慎重に取り除きます。脳皮質を10mLの1x HBSSが入った50mLの円錐管に移し、氷の上に置きます。
3. 細胞培養における脳の解離と皮質ニューロンの播種
   注意: バイオセーフティキャビネットで後続のすべての手順を実行します。
   1. 50mLの円錐形チューブに脳を約^1mm2 個にミンチにし、滅菌済みの使い捨てメスの刃で入れます。みじん切りにした脳を新しい滅菌50mLコニカルチューブに移します。
   2. トリプシンを最終濃度0.25%でチューブに加えます。チューブを35〜38°Cの温水浴に15分間浸し、チューブを穏やかに混合して2〜3分ごとに組織を均質化します。
   3. 湯煎からチューブを取り出します。組織懸濁液を静かに上下にピペットで動かして細胞をさらに解離し、均質化した懸濁液に0.5 mLの熱不活化FBSを加えてトリプシン活性を中和します。神経細胞への毒性を最小限に抑えるために、気泡を避けてください。
   4. 滅菌済みの70 μmナイロンメッシュセルストレーナーを滅菌済みの50 mLコニカルチューブに置き、約5 mLの神経基礎培地を加えてメッシュを濡らします。70 μmナイロンメッシュセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。1 mLシリンジプランジャーを使用して、組織を細胞ストレーナーに優しく粉砕します。約5mLの1x HBSSを定期的に注ぎながら、粉砕を続けて細胞ストレーナーを洗浄します。
   5. コニカルチューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 この間に、B-27 plusサプリメントをニューロベースルプラス培地で最終濃度の1倍に希釈して、完全なニューロベース培地として使用します。
   6. POをT-25フラスコに捨て、フラスコを5mLの1x PBSで3回すすいでください。
   7. 慎重にデカントして上清を取り除き、2〜3 mLの完全神経基礎培地を穏やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。血球計算盤とトリパンブルーで細胞濃度と総細胞数を決定します。胚あたり最大1.0 x 10⁷ 個の細胞が期待されます。
   8. POコーティングされたT-25フラスコの細胞に、フラスコあたり約2.0 x 10⁷ 個の細胞を5 mLの完全神経基礎培地に播種します。細胞培養物を5% CO₂ インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
   9. 培養フラスコから2.5 mLの培地を新しく作成した完全な神経基礎培地に交換することにより、2〜3日ごとに半培地交換を行います。

3. 初代神経細胞とミクログリアの共培養

注:後続のすべての手順は、滅菌済みのバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。

1. 96ウェルプレートへのニューロンの播種
   1. 10 μg/mL POをウェルあたり100 μL加え、フラスコを37°Cで少なくとも1時間インキュベートして、ウェルをPOでコーティングします。細胞を播種する前にプレートを1x PBSで3回洗浄し、最後の洗浄後に残った液体を吸引します。
   2. T-25フラスコで増殖したニューロンは、培養で2〜5日後に共培養のために回収されます。培地を5 mLの1x Versene溶液(0.25%トリプシンおよび1 mg/mL DNase Iを含む溶液)と交換して、フラスコからニューロンを分離します。フラスコをインキュベーター内に5〜6分間置いて消化し、細胞の剥離を助けるために2〜3分ごとにフラスコを静かに回転させます。
   3. インキュベーターからフラスコを取り出し、顕微鏡で細胞が剥がれているかどうかを確認します。0.5 mLの熱不活化FBSを加えて、トリプシンとDNase Iを中和し、細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。フラスコを5mLの完全神経基礎培地で一度洗浄し、収集したニューロンを最大化します。すべての細胞を同じ15 mLコニカルチューブに集めます。
   4. 細胞懸濁液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを2〜3mLの完全神経基礎培地に穏やかに再懸濁します。
   5. 血球計算盤で細胞をカウントし、完全な神経基礎培地を添加して、最終濃度7.5 x 10⁵ ニューロン/mLを達成します。POコーティングされた96ウェルプレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液を播種して、7.5 x 10⁴ ニューロン/ウェルを得ます。フラスコあたり500万〜600万個のニューロンの収量が期待されます。
   6. ニューロンを96ウェルプレートで一晩インキュベートします。翌日、100 μLの完全ニューロベース培地を各ウェルに加えます。
      注:ニューロンが適切な神経突起プロセスの成長を示すと(96ウェルプレートに播種した後の3〜4日目頃)、ニューロンはミクログリアとの共培養の準備が整います。
2. 分離とミクログリア-ニューロン共培養
   1. 混合グリア培養の8〜10日の間に、10mLピペットで各フラスコ内のT-75フラスコをグリア培養培地で優しく洗浄してミクログリアを収集し、細胞と培地を滅菌済みの50mLコニカルチューブに移します。フラスコを10 mLの新鮮なグリア培養培地で再度洗浄し、フラスコから追加のミクログリアを分離し、培地を収集します。フラスコあたり7.5 x 10⁵ マイクログリアの収量が期待されます。
   2. 20 ng/mL MCSFを添加した20 mLの新鮮なグリア培養培地を各フラスコに加えます。ミクログリアは、混合グリア培養が維持されていれば、さらに1回または2回収穫することができます。
   3. セルコレクションを300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に取り除き、ペレットを2 mLの完全神経基礎培地に静かに再懸濁します。
   4. 血球計算盤とトリパンブルーで細胞を数えます。完全な神経基礎培地を最終濃度2.5 x 10⁵ 細胞/mLまで添加します。
   5. 96ウェルニューロン培養プレートから、100 μLの神経基礎培地を取り出し、100 μLの2.5 x 10⁵細胞/mL細胞懸濁液を添加して、7.5 x 10⁴ニューロンのウェルあたり2.5 x 10⁴マイクログリアを播種します。培養物を5% CO₂インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートし、ミクログリアが沈殿するまで待ちます。共培養は、現在、下流の実験に使用できます。

結果

ミクログリアの混合グリア培養の主要なステップを示すフローチャートを 図1Aに示します。全体として、1日目にはスパースな細胞と過剰な細胞破片が予想されます(図1B)。4日目までに、特に接着性アストロサイトの生成とともに、細胞数の増加が観察されるはずです(図1C)。アストロサイトの上には、いくつかのミクログリア...

ディスカッション

この記事では、マウスの初代ニューロンと初代ミクログリアを単離および培養するためのプロトコルについて説明し、その後、ミクログリアとニューロンの相互作用が細胞の健康と機能をどのように制御するかを研究するために使用できるミクログリア-ニューロン共培養を確立するために使用されます。この比較的単純でアクセス可能なアプローチは、CNSにおけるミクログリアニューロン相...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss