マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

要約

このプロトコルは、胚の日15-16でマウスの胚から単離された初代ニューロン細胞から確立されたミクログリア-ニューロン共培養と、出生後1-2日に新生児マウスの脳から生成された初代ミクログリアを説明しています。

要約

ミクログリアは、中枢神経系(CNS)の組織に常在するマクロファージであり、ニューロンの健康とCNSの恒常性をサポートする多くの機能を果たしています。彼らは、CNS疾患の活動性に関連する免疫細胞の主要な集団であり、多発性硬化症(MS)などの慢性神経変性疾患における神経損傷に寄与する可能性のある反応性表現型を採用しています。ミクログリアが健康および疾患中のニューロン機能と生存を制御する明確なメカニズムは、ミクログリア、ニューロン、およびその他のCNS環境因子との間の複雑な in vivo 相互作用を解決する上での課題のために、依然として限られています。したがって、ミクログリアとニューロンを共培養する in vitro アプローチは、ミクログリアとニューロンの相互作用を研究するための貴重なツールであり続けています。ここでは、マウスから初代ミクログリアとニューロンを作製し、共培養するためのプロトコールを紹介します。具体的には、ミクログリアは、出生後0〜2日の間に新生児マウス由来の脳ホモジネートから確立された混合グリア培養物から in vitro で9〜10日後に単離されました。ニューロン細胞は、胚の16-18日の間にマウス胚の脳皮質から単離された。 in vitroで4〜5日後、ニューロン細胞を96ウェルプレートに播種し、続いてミクログリアを添加して共培養を形成しました。このプロトコルでは、両方の細胞タイプが共培養を確立するために実験的成熟に達する必要があるため、慎重なタイミングが重要です。全体として、この共培養はミクログリアとニューロンの相互作用の研究に有用であり、免疫蛍光顕微鏡法、ライブイメージング、RNAおよびタンパク質アッセイなど、複数の読み出しを提供できます。

概要

ミクログリアは、中枢神経系(CNS^{)における}免疫サーベイランスと恒常性を促進する組織常在性マクロファージです^1,2,3。それらは、^{胚発生中に}脳にコロニーを形成する卵黄嚢赤骨髄前駆細胞に由来し、^4,5,6、^増殖とアポトーシス7を含む自己複製を通じて生物の寿命を通じて維持^{されます。}定常状態では、休止中のミクログリアは形態を分岐させ、組織監視に従事しています^8,9,10。

ミクログリアは多数の細胞表面受容体を発現するため、中枢神経系の変化に迅速に反応し^11,12、感染症や組織損傷^の場合12,13,14、多発性硬化症(M....

プロトコル

この研究で使用されたすべての動物は、サスカチュワン大学の大学動物管理委員会(UACC)およびカナダ動物管理評議会(CCAC)の承認を得て飼育および取り扱われました。この研究では、妊娠中のCD1マウスの出生後0-2日目のCD1オスとメスのマウスと、妊娠したCD1マウスの胚16-18日目(E16-18)の胚を使用しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 初代ミクログリアの培養

注:ニューロンが96ウェルプレートに播種されてから2日以内にミクログリアが成熟し、収穫の準備が整うように、混合グリアとニューロン培養の時間を計ることが重要です。

1. 準備
   1. 高グルコースを添加したダルベッコ改変鷲培地(DMEM)に10%熱不活化ウシ胎児血清、50 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンと2.92 mg/mLのL-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、および20 mMのHEPESを37°Cの水浴で調製した予備温グリア培養培地。
   2. 5 mLの10 μg/mLポリ-L-オルニチン(PO)臭化水素酸塩を各T-75フラスコに加えます。フラスコを静かに回転させて、POがフラスコの底を完全に覆うようにします。5% CO₂ インキュベーターで37°Cで少なくとも....

ディスカッション

この記事では、マウスの初代ニューロンと初代ミクログリアを単離および培養するためのプロトコルについて説明し、その後、ミクログリアとニューロンの相互作用が細胞の健康と機能をどのように制御するかを研究するために使用できるミクログリア-ニューロン共培養を確立するために使用されます。この比較的単純でアクセス可能なアプローチは、CNSにおけるミクログリアニューロン相.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss