Генерация и совместное культивирование первичной микроглии и корковых нейронов мышей

Резюме

Этот протокол описывает кокультуру микроглии и нейронов, созданную из первичных нейрональных клеток, выделенных из эмбрионов мышей на 15-16 день эмбрионального периода, и первичной микроглии, полученной из мозга неонатальных мышей на 1-2 день после рождения.

Аннотация

Микроглия — это тканевые резидентные макрофаги центральной нервной системы (ЦНС), выполняющие многочисленные функции, поддерживающие здоровье нейронов и гомеостаз ЦНС. Они представляют собой основную популяцию иммунных клеток, связанных с активностью заболевания ЦНС, принимая реактивные фенотипы, которые потенциально способствуют повреждению нейронов во время хронических нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Различные механизмы, с помощью которых микроглия регулируют функцию нейронов и выживаемость во время здоровья и болезни, остаются ограниченными из-за проблем в разрешении сложных взаимодействий in vivo между микроглией, нейронами и другими факторами окружающей среды ЦНС. Таким образом, подход in vitro к совместному культивированию микроглии и нейронов остается ценным инструментом для изучения микроглии и нейронных взаимодействий. В этой статье мы представляем протокол генерации и совместного культивирования первичной микроглии и нейронов у мышей. В частности, микроглия была выделена через 9-10 дней in vitro из смешанной культуры глии, полученной из гомогенатов мозга, полученных от неонатальных мышей между 0-2 днями после рождения. Нейрональные клетки были выделены из коры головного мозга эмбрионов мышей между 16-18 днями эмбрионального периода. После 4-5 дней in vitro нейрональные клетки засеивали в 96-луночные планшеты с последующим добавлением микроглии для формирования кокультуры. Тщательное определение времени имеет решающее значение для этого протокола, поскольку оба типа клеток должны достичь экспериментальной зрелости для создания совместной культуры. В целом, эта кокультура может быть полезна для изучения взаимодействий микроглии и нейронов и может обеспечить многократное считывание, включая иммунофлуоресцентную микроскопию, живую визуализацию, а также анализы РНК и белков.

Введение

Микроглия – это тканевые резидентные макрофаги, которые способствуют иммунонадзору и гомеостазу в центральной нервной системе (ЦНС)^1,2,3. Они происходят из эритромиелоидных клеток-предшественников желточного мешка, которые колонизируют мозг во время эмбрионального развития ^4,5,6 и поддерживаются на протяжении всей жизни организма за счет самообновления, которое включает пролиферацию и апоптоз⁷. В равновесном состоянии микроглия в состоянии покоя имеет разветвл....

протокол

Все животные, использованные в этом исследовании, были размещены и обработаны с одобрения Университетского комитета по уходу за животными (UACC) Университета Саскачевана и Канадского совета по уходу за животными (CCAC). Для исследования использовали эмбрионы 0-2 дней CD1 самцов и самок мышей и эмбрионы 16-18 дней (E16-18) беременных мышей с CD1. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Первичная культура микроглии

ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно рассчитать время для смешанных культур глии и нейронов так, чтобы микроглия созрела и была....

Результаты

Блок-схема, показывающая основные этапы формирования смешанной культуры глии для микроглии, показана на рисунке 1A. В целом, в 1-й день ожидается разреженность клеток и чрезмерное количество клеточного мусора (рисунок 1B). К 4-му дню следует наблюдать увелич.......

Обсуждение

В этой статье описывается протокол выделения и культивирования первичных нейронов и первичной микроглии мыши, которые впоследствии используются для создания кокультуры микроглии и нейронов, которая может быть использована для изучения того, как взаимодействия микроглии и нейронов р.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss