Génération et co-culture de microglie primaire murine et de neurones corticaux

Résumé

Ce protocole décrit une co-culture microgliale-neuronale établie à partir de cellules neuronales primaires isolées d’embryons de souris aux jours embryonnaires 15-16 et de microglie primaire générée à partir du cerveau de souris néonatales aux jours postnatals 1er-2.

Résumé

Les microglies sont des macrophages tissulaires du système nerveux central (SNC), remplissant de nombreuses fonctions qui soutiennent la santé neuronale et l’homéostasie du SNC. Il s’agit d’une population importante de cellules immunitaires associées à l’activité de la maladie du SNC, adoptant des phénotypes réactifs qui peuvent contribuer aux lésions neuronales lors de maladies neurodégénératives chroniques telles que la sclérose en plaques (SEP). Les mécanismes distincts par lesquels les microglies régulent la fonction neuronale et la survie au cours de la santé et de la maladie restent limités en raison des défis liés à la résolution des interactions complexes in vivo entre la microglie, les neurones et d’autres facteurs environnementaux du SNC. Ainsi, l’approche in vitro de la co-culture de la microglie et des neurones reste un outil précieux pour l’étude des interactions microglie-neurones. Ici, nous présentons un protocole pour générer et co-cultiver des microglies primaires et des neurones à partir de souris. Plus précisément, les microglies ont été isolées après 9 à 10 jours in vitro à partir d’une culture gliale mixte établie à partir d’homogénats cérébraux dérivés de souris néonatales entre les jours postnatals 0 et 2. Des cellules neuronales ont été isolées à partir de cortex cérébraux d’embryons de souris entre les jours embryonnaires 16 et 18. Après 4 à 5 jours in vitro, les cellules neuronales ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits, suivies de l’ajout de microglie pour former la co-culture. Un timing minutieux est essentiel pour ce protocole, car les deux types de cellules doivent atteindre la maturité expérimentale pour établir la co-culture. Dans l’ensemble, cette co-culture peut être utile pour étudier les interactions microglie-neurone et peut fournir plusieurs lectures, y compris la microscopie d’immunofluorescence, l’imagerie en direct, ainsi que des dosages d’ARN et de protéines.

Introduction

Les microglies sont des macrophages résidants dans les tissus qui facilitent l’immunosurveillance et l’homéostasie dans le système nerveux central (SNC)^1,2,3. Ils proviennent de cellules progénitrices érythromyéloïdes du sac vitellin qui colonisent le cerveau pendant le développement embryonnaire ^4,5,6 et sont maintenues tout au long de la vie de l’organisme par l’auto-renouvellement, ce qui implique la prolifération et l’apoptose⁷. À l’état d’équilibre, les m....

Protocole

Tous les animaux utilisés dans cette étude ont été logés et manipulés avec l’approbation du Comité universitaire de protection des animaux (CCAC) de l’Université de la Saskatchewan et du Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Des souris mâles et femelles CD1 postnatales de jours 0 à 2 et des embryons embryonnaires de souris CD1 enceintes de jours 16 à 18 (E16-18) ont été utilisés pour cette étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture de microglie primaire

REMARQUE : Il est crucial de chronométrer le....

Discussion

Cet article décrit un protocole permettant d’isoler et de cultiver des neurones primaires et des microglies primaires de souris, qui sont ensuite utilisés pour établir une co-culture microglie-neuronale qui peut être utilisée pour étudier comment les interactions microgliales et neuronales régulent leur santé et leur fonction cellulaires. Cette approche relativement simple et accessible peut fournir des informations essentielles sur les mécanismes et les résultats fonctionnels des interactions des neurones mi.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss