Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Zusammenfassung

Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS), die zahlreiche Funktionen erfüllen, die die neuronale Gesundheit und die ZNS-Homöostase unterstützen. Sie sind eine wichtige Population von Immunzellen, die mit der Aktivität der ZNS-Erkrankung assoziiert sind und reaktive Phänotypen annehmen, die möglicherweise zu neuronalen Schädigungen bei chronischen neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) beitragen. Die unterschiedlichen Mechanismen, durch die Mikroglia die neuronale Funktion und das Überleben während Gesundheit und Krankheit regulieren, bleiben aufgrund von Herausforderungen bei der Lösung der komplexen In-vivo-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia, Neuronen und anderen ZNS-Umweltfaktoren begrenzt. Daher bleibt der in vitro-Ansatz der Co-Kultivierung von Mikroglia und Neuronen ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronal-Interaktionen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung und Co-Kultur von primären Mikroglia und Neuronen aus Mäusen vor. Konkret wurden Mikroglia nach 9-10 Tagen in vitro aus einer gemischten Gliakultur isoliert, die aus Gehirnhomogenaten von neugeborenen Mäusen zwischen den postnatalen Tagen 0-2 etabliert wurde. Neuronale Zellen wurden zwischen dem 16. und 18. Embryonaltag aus der Hirnrinde von Mausembryonen isoliert. Nach 4-5 Tagen in vitro wurden die neuronalen Zellen in 96-Well-Platten ausgesät, gefolgt von der Zugabe von Mikroglia, um die Co-Kultur zu bilden. Ein sorgfältiges Timing ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung, da beide Zelltypen die experimentelle Reife erreichen müssen, um die Co-Kultur zu etablieren. Insgesamt kann diese Co-Kultur für die Untersuchung von Mikroglia-Neuronen-Interaktionen nützlich sein und mehrere Messwerte liefern, einschließlich Immunfluoreszenzmikroskopie, Live-Bildgebung sowie RNA- und Protein-Assays.

Einleitung

Mikroglia sind geweberesidente Makrophagen, die die Immunüberwachung und Homöostase im Zentralnervensystem (ZNS) ^{erleichtern1,2,3}. Sie stammen aus erythromyeloiden Vorläuferzellen des Dottersacks, die das Gehirn während der Embryonalentwicklung besiedeln ^4,5,6 und während der gesamten Lebensspanne des Organismus durch Selbsterneuerung, die Proliferation und Apoptose beinhaltet, erhalten bleiben⁷. Im Steady-State haben ruhende Mikroglia die Morphologie verzweig....

Protokoll

Alle Tiere, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden mit Genehmigung des University Animal Care Committee (UACC) der University of Saskatchewan und des Canadian Council on Animal Care (CCAC) untergebracht und behandelt. Für diese Studie wurden männliche und weibliche CD1-Mäuse an den postnatalen Tagen 0-2 und Embryonen an den Tagen 16-18 (E16-18) von trächtigen CD1-Mäusen verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Primäre Mikroglia-Kultur

HINWEIS: Es ist wichtig, die gemischten Gliazellen und neuronalen Kultu....

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von primären Mausneuronen und primären Mikroglia, die anschließend verwendet werden, um eine Mikroglia-Neuronal-Co-Kultur zu etablieren, mit der untersucht werden kann, wie Mikroglia- und Neuroneninteraktionen ihre zelluläre Gesundheit und Funktion regulieren. Dieser relativ einfache und zugängliche Ansatz kann wichtige Einblicke in die Mechanismen und funktionellen Ergebnisse von Mikroglia-Neuroneninteraktionen im ZNS liefern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss