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요약

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

초록

미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 신경 건강과 중추신경계 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 이들은 중추신경계 질환 활동과 관련된 면역 세포의 주요 집단으로, 다발성 경화증(MS)과 같은 만성 신경퇴행성 질환 중 신경 손상에 잠재적으로 기여하는 반응성 표현형을 채택합니다. 미세아교세포가 건강 및 질병 중 신경 기능과 생존을 조절하는 뚜렷한 메커니즘은 미세아교세포, 뉴런 및 기타 CNS 환경 요인 간의 복잡한 생체 내 상호 작용을 해결하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되어 있습니다. 따라서 미세아교세포와 뉴런을 함께 배양하는 체외 접근법은 미세아교세포-뉴런 상호작용을 연구하기 위한 유용한 도구로 남아 있습니다. 여기에서는 생쥐에서 일차 미세아교세포와 뉴런을 생성하고 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, 미세아교세포는 출생 후 일 0-2일 사이에 신생아 마우스에서 유래한 뇌 균질액으로부터 확립된 혼합 신경교세포(glia) 배양으로부터 시험관내에서 9-10일 후에 분리하였다. 신경 세포는 배아 16-18일 사이에 마우스 배아의 뇌 피질에서 분리되었습니다. 시험관 내에서 4-5일 후, 신경 세포를 96웰 플레이트에 파종한 후 미세아교세포를 추가하여 공동 배양을 형성했습니다. 이 프로토콜은 두 세포 유형 모두 공동 배양을 확립하기 위해 실험적 성숙도에 도달해야 하기 때문에 신중한 타이밍이 중요합니다. 전반적으로 이 공동 배양은 미세아교세포-뉴런 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있으며 면역형광 현미경 검사, 실시간 이미징, RNA 및 단백질 분석을 포함한 여러 판독값을 제공할 수 있습니다.

서문

미세아교세포(Microglia)는 중추신경계(CNS)의 면역감시 및 항상성을 촉진하는 조직 상주 대식세포입니다1,2,3. 난황낭 적혈구세포 전구세포(yolk sac erythromyeloid progenitor cell)에서 유래하며, 배아 발달 과정에서 뇌에 서식하며4,5,6 증식과 세포자멸사(apoptosis)를 수반하는 자가재생(self-renewal)을 통해 유기체의 수명 동안 유지된다7. 정상 상태에서, 휴지 상태의 미세아교세포는 형태학을 파급시키고 조직 감시에 참여한다 8,9,10.

미세아교세포는 수많은 세포 표면 수용체를 발현하여 중추신경계의 변화에 신속하게 반응할 수 있습니다

프로토콜

이 연구에 사용된 모든 동물은 서스캐처원 대학의 대학 동물 관리 위원회(UACC)와 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)의 승인을 받아 수용 및 처리되었습니다. 이 연구에는 출생 후 0-2일 CD1 수컷 및 암컷 마우스와 임신한 CD1 마우스의 배아 16-18일(E16-18) 배아가 사용되었습니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 원발성 미세아교세포 배양

참고: 미세아교세포가 성숙하고 뉴런이 96웰 플레이트에 파종된 후 2일 이내에 수확할 준비가 되도록 혼합 신경교세포와 뉴런 배양 시간을 정하는 것이 중요합니다.

  1. 준비
    1. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청이 보충된 고포도당이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM), L-글루타민 2.92mg/mL, 1mM 피루브산 나트륨, 1mM 비필수 아미노산 및 20mM의 HEPES가 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)이 포함된 37°C 수조에서 사전 데우기.
    2. 각 T-75 플라스크에 5mL의 10μg/mL 폴리-L-오르니틴(PO) ....

대표적 결과

미세아교세포에 대한 혼합신경교세포(mixed glia) 배양의 주요 단계를 보여주는 흐름도가 그림 1A에 나와 있습니다. 전반적으로, 1일차에는 희박한 세포와 과도한 세포 파편이 예상됩니다(그림 1B). 4일째가 되면 특히 부착성 성상세포(adherent astrocyte)의 생성과 함께 세포 수가 증가하는 것이 관찰되어야 하며, 이는 길쭉한 형태에서 알 수 있습니다(

토론

이 논문에서는 생쥐의 1차 뉴런과 1차 미세아교세포를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜에 대해 설명하며, 이후 미세아교세포와 미세아교세포의 상호 작용이 세포 건강과 기능을 조절하는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있는 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 확립하는 데 사용됩니다. 이 비교적 간단하고 접근하기 쉬운 접근법은 중추신경계에서 미세아교세포 뉴런 상호작용의 메커니즘과 기?.......

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

JP는 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)와 서스캐처원 대학교 의과대학(University of Saskatchewan College of Medicine)의 자금 지원을 인정합니다. YD는 University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 Discovery Grant(RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant(1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant(6368) 및 Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant의 자금 지원을 인정합니다. 그림 1A, 그림 2A그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dish Fisher 07-202-011Sterile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401
Dissection microscopeVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 21083027
Macrophage colony stimulating factor Peprotech315-02
Micro-ForcepsRWDF11020-11Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acidsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide SigmaP3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
Spring scissorsRWDS11008-42Autoclaved/Sterile
Surgical bladeFeather08-916-5DSterile
T-25 flasksFisher10-126-9
T-75 flasks Fisher13-680-65
Tissue forcepsCodman30-4218Autoclaved/Sterile
Tissue scissorsRWDS12052-10Autoclaved/Sterile
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2.5%)ThermoFisher Sci15090046
Widefield Immunofluorescence MicroscopeZeiss

참고문헌

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O.

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