استخراج الفرمون الجنسي المتطاير ومقايسة الجذب الكيميائي في Caenorhabditis elegans

Summary

يحدد هذا البروتوكول طرقا لاستخراج وقياس الاستجابات للفرمون الجنسي المتطاير في C. ايليجانس، مما يوفر أدوات لدراسة الاتصال الكيميائي ومسار الملاحة.

Abstract

يعد الاتصال الكيميائي أمرا حيويا في صحة الكائنات الحية والتكاثر والرفاهية العامة. يظل فهم المسارات الجزيئية والعمليات العصبية والحسابات التي تحكم هذه الإشارات مجالا نشطا للبحث. توفر الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans نموذجا قويا لدراسة هذه العمليات لأنها تنتج فرمون جنسي متطاير. يتم تصنيع هذا الفرمون بواسطة الإناث البكر أو الخنثى المستنفدة للحيوانات المنوية ويعمل كعامل جذب للذكور.

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعزل الفرمون الجنسي المتطاير عن عدة C. ايليجانس سلالات (WT سلالة N2 و daf-22 و fog-2) و C. remanei. نقدم أيضا بروتوكولا لتحديد استجابة الانجذاب الكيميائي للذكور للفرمون الجنسي المتطاير. يستخدم تحليلنا قياسات مثل مؤشر الانجذاب الكيميائي (CI) ، ووقت الوصول (ATTA) ، ومخطط المسار لمقارنة استجابات الذكور في ظل ظروف مختلفة بدقة. تسمح هذه الطريقة بإجراء مقارنات قوية بين الذكور من خلفيات وراثية مختلفة أو مراحل النمو. علاوة على ذلك ، فإن الإعداد التجريبي الموضح هنا قابل للتكيف مع التحقيق في مواد كيميائية أخرى للجذب الكيميائي.

Introduction

يعد التفاعل بين الاتصال الكيميائي والنجاح الإنجابي مبدأ أساسيا في جميع أنحاء مملكة^{1،2،3،4،5،6،7،8،9،10}. تؤدي الفيرومونات الجنسية إلى مجموعة واسعة من السلوكيات ثنائية الشكل جنسيا الضرورية لتحديد مكان الأصدقاء ، وتنسيق الخطوات المتبعة في العثور على شريك وجذبه ، وفي النهاية تعزيز تكاثر الأنواع

Protocol

1. استخراج الفرمون الجنسي الخام من الإناث والخنثى

1. بروتوكول مزامنة C. ايليجانس
   1. تحضير الإناث البالغات أو الخنثى
      1. راقب لوحات الاستزراع يوميا حتى يوجد عدد كبير من الإناث / الخنثى البالغات ويستنفد مصدر غذاء OP50. باستخدام fog-2 C. ايليجانس و WT C. remanei الإناث لاستخراج الفرمون الجنسي الخام ، قم بإعداد بيض متزامن من الإناث المتزاوجة.
         ملاحظة: في هذا البروتوكول ، C. ايليجانس الضباب -2 المتحولة XX ، التي لا تنتج المنوية الذاتية ، يشار إليها باسم C. ايليجانس الإناث.
   2. غسل الديدان وتكويرها
      1. اغسل الديدان البالغة من لوحة مختلطة با....

النتائج

تحليل المسار لإدراك الفرمون الجنسي المتطاير سلالة معيبة في مقايسة الجذب الكيميائي
يميز اختبار الجذب الكيميائي هذا بشكل موثوق بين السلالات البرية والمتحولة من C. ايليجانس في استجابتها للفيرومونات الجنسية المتطايرة. تظهر التجارب الناجحة معه - 5 ذكور ?.......

Discussion

يوفر هذا البروتوكول منهجية قوية لاستخراج الفيرومونات الجنسية المتطايرة من C. ايليجانس، إلى جانب إنشاء مقايسة قوية للجذب الكيميائي لقياس استجابات الجذب الكيميائي للذكور. يمكن العثور على معلومات إضافية في دليل مستخدم WormLab (انظر جدول المواد) ؛ للحصول على رمز .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips