Экстракция летучих половых феромонов и химиоаттракция у Caenorhabditis elegans

Резюме

Этот протокол устанавливает методы извлечения и количественной оценки ответов на летучий половой феромон у C. elegans, предоставляя инструменты для изучения химической коммуникации и траектории навигации.

Аннотация

Химическая коммуникация жизненно важна для здоровья организма, размножения и общего благополучия. Понимание молекулярных путей, нейронных процессов и вычислений, управляющих этими сигналами, остается активной областью исследований. Нематода Caenorhabditis elegans представляет собой мощную модель для изучения этих процессов, поскольку она продуцирует летучий половой феромон. Этот феромон синтезируется девственными самками или истощенными спермой гермафродитами и служит аттрактантом для самцов.

В этом протоколе подробно описан метод выделения летучего полового феромона из нескольких штаммов C. elegans (штамм WT N2, daf-22 и fog-2) и C. remanei. Мы также предоставляем протокол для количественной оценки мужской реакции хемотаксиса на летучий половой феромон. В нашем анализе используются такие измерения, как индекс хемотаксиса (C.I.), время прибытия (A.T.) и график траектории для точного сравнения реакций самцов в различных условиях. Этот метод позволяет проводить надежные сравнения между самцами с разным генетическим происхождением или стадиями развития. Кроме того, описанная здесь экспериментальная установка может быть адаптирована к исследованию других химических веществ хемопритяжения.

Введение

Взаимодействие между химической коммуникацией и репродуктивным успехом является фундаментальным принципом в животном царстве 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Половые феромоны вызывают широкий спектр полового диморфизма, необходимого для поиска партнеров, координации шагов, связанных с поиском и привлечением партн....

протокол

1. Экстракция сырых половых феромонов у самок и гермафродитов

1. Протокол для синхронизации C. elegans
   1. Подготовка взрослых самок или гермафродитов
      1. Ежедневно контролируйте культуральные планшеты до тех пор, пока не появится большая популяция взрослых самок/гермафродитов и не истощится источники пищи OP50. Используя самок fog-2 C. elegans и WT C. remanei для экстракции сырых половых феромонов, готовят синхронизированные яйца от спаренных самок.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мутантные животные C. elegans fog-2 XX, которые не производят собственный сперматозоид, ....

Результаты

Траекторный анализ дефектного штамма восприятия летучих половых феромонов в анализе хемоаттракции
Этот анализ хемоаттракции надежно дифференцирует дикий тип и мутантные штаммы C. elegans в их реакции на летучие половые феромоны. Успешные эксперименты с .......

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает надежную методологию экстракции летучих половых феромонов из C. elegans, а также создание надежного анализа хемоаттракции для измерения реакций самцов на хемоаттракцию. Дополнительную информацию можно найти в руководстве пользователя Wor.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips