Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

요약

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

초록

화학적 의사소통은 유기체의 건강, 번식 및 전반적인 웰빙에 매우 중요합니다. 이러한 신호를 제어하는 분자 경로, 신경 과정 및 계산을 이해하는 것은 여전히 활발한 연구 분야입니다. 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )은 휘발성 성 페로몬을 생성하기 때문에 이러한 과정을 연구하기 위한 강력한 모델을 제공합니다. 이 페로몬은 처녀 암컷이나 정자가 고갈된 자웅동체에 의해 합성되며 수컷의 유인제 역할을 합니다.

이 프로토콜은 여러 예쁜꼬마선 충 균주(WT 균주 N2, daf-22 및 fog-2) 및 C. remanei에서 휘발성 성 페로몬을 분리하는 자세한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 휘발성 성 페로몬에 대한 남성 화학주성 반응을 정량화하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 우리의 분석은 화학주성 지수(C.I.), 도착 시간(A.T.) 및 궤적 플롯과 같은 측정을 활용하여 다양한 조건에서 남성의 반응을 정확하게 비교합니다. 이 방법을 사용하면 서로 다른 유전적 배경 또는 발달 단계를 가진 남성 간의 강력한 비교가 가능합니다. 또한, 여기에 설명된 실험 설정은 다른 화학 인력 화학 물질을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

서문

화학적 의사소통과 번식 성공 사이의 상호작용은 동물계 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 전반에 걸친 기본 원칙이다. 섹스 페로몬은 짝을 찾고, 파트너를 찾고 끌어들이는 데 관련된 단계를 조정하고, 궁극적으로 종의 번식을 촉진하는 데 필수적인 다양한 성적 이형 행동을 유발합니다 11,12,13,14,15,16,17

프로토콜

1. 여성과 자웅동체에서 조잡한 성 페로몬 적출

1. 예쁜꼬마선충 동기화를 위한 프로토콜
   1. 성인 여성 또는 자웅동체의 준비
      1. 성인 암컷/자웅동체의 많은 개체군이 존재하고 OP50 식품 공급원이 고갈될 때까지 매일 배양 플레이트를 모니터링합니다. 조잡한 성 페로몬 추출을 위해 fog-2 C. elegans 및 WT C. remanei 암컷을 사용하여 짝짓기 된 암컷에서 동기화 된 난자를 준비합니다.
         참고: 이 프로토콜에서는 자가 정자를 생산하지 않는 예쁜꼬마선충 안개-2 돌연변이 XX 동물을 예쁜꼬마선충 암컷이라고 합니다.
   2. 웜 세척 및 펠릿
      1. M9 완충액이 있는 혼합 개체군 플레이트에서 성인 벌레를 씻어냅니다. 웜 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다. 1,500× g 에서 0.5-1분 동안 원심분리하여 웜을 펠릿화합니다.
         알림: 심한 오염에 대한 사전 세척(선택 사항): 심하게 오염된 경우 벌레가 튜브에 가라앉도록 하십시오. 상층액을 피펫팅하여 박테리아를 제거하고 상층액이 투명해질 때까지 반복합....

토론

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 휘발성 성 성 페로몬을 추출하기 위한 강력한 방법론을 제공하며, 남성의 화학인력 반응을 측정하기 위한 강력한 화학인력 분석을 수립합니다. 추가 정보는 WormLab 사용자 가이드에서 찾을 수 있습니다(재료 표 참조). WORM 이동 궤적을 시각화하는 기본 코드는 프로토콜 섹션 7.3.8.5를 참조하십시오. 프로토콜의 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips