מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

Summary

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

Abstract

תקשורת כימית חיונית לבריאות האורגניזם, לרבייה ולרווחה הכללית. הבנת המסלולים המולקולריים, התהליכים העצביים והחישובים השולטים באותות אלה נותרה תחום מחקר פעיל. הנמטודה Caenorhabditis elegans מספקת מודל רב עוצמה לחקר תהליכים אלה מכיוון שהיא מייצרת פרומון מין נדיף. פרומון זה מסונתז על ידי נקבות בתולות או הרמפרודיטים מדולדלי זרע ומשמש כמושך לזכרים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לבידוד פרומון המין הנדיף ממספר זנים של C. elegans (זן WT N2, daf-22 ו-fog-2) ו-C. remanei. אנו מספקים גם פרוטוקול לכימות תגובת הכימוטקסיס הגברית לפרומון המין הנדיף. הניתוח שלנו משתמש במדידות כגון מדד כימוטקסיס (C.I.), זמן הגעה (A.T.) ותרשים מסלול כדי להשוות במדויק תגובות גברים בתנאים שונים. שיטה זו מאפשרת השוואה חזקה בין זכרים בעלי רקע גנטי שונה או שלבי התפתחות שונים. יתר על כן, מערך הניסוי המתואר כאן ניתן להתאמה לחקר כימיקלים כימותרפיים אחרים.

Introduction

יחסי הגומלין בין תקשורת כימית להצלחת הרבייה הם עיקרון בסיסי ברחבי ממלכת החי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. פרומוני מין מעוררים מגוון רחב של התנהגויות דימורפיות מיניות החיוניות לאיתור בני זוג, תיאום הצעדים הכרוכים במציאת בן זוג ובמשיכתו, ובסופו של דבר לקידום התפשטות המין 11,12,13,14,15,16,17

Protocol

1. מיצוי פרומון מין גס מנקבות והרמפרודיטים

1. פרוטוקול לסנכרון C. elegans
   1. הכנת נקבות בוגרות או הרמפרודיטים
      1. יש לעקוב אחר צלחות התרבית מדי יום עד שקיימת אוכלוסייה גדולה של נקבות/הרמפרודיטים בוגרים ומקור המזון OP50 מתרוקן. בעזרת נקבות ערפל-2 C. elegans ו-WT C. remanei להפקת פרומון מין גולמי, מכינים ביצים מסונכרנות מהנקבות המזווגות.
         הערה: בפרוטוקול זה, חיות XX מוטנטיות מסוג C. elegans fog-2 , שאינן מייצרות זרע עצמי, נקראות נקבות C. elegans .
   2. כביסה וגלולות תולעים
      1. שטפו תולעים בוגרות מצלחת אוכלוסייה מעורבת עם חיץ M9. לאסוף תר....

תוצאות

ניתוח מסלול של תפיסת פרומון מין נדיף זן פגום בבדיקת כימותרפיה
בדיקת כימותרפיה זו מבחינה באופן אמין בין זנים פראיים וזנים מוטנטיים של C. elegans בתגובתם לפרומוני מין נדיפים. ניסויים מוצלחים עם זכרי HIM-5 הדגימו באופן עקבי כימוטקסיס חזק כלפי מקור הפרומון. זה.......

Discussion

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה חזקה להפקת פרומוני מין נדיפים מ- C. elegans, יחד עם הקמת בדיקת כימותרפיה חזקה למדידת תגובות כימותרפיות גבריות. מידע נוסף ניתן למצוא במדריך למשתמש של WormLab (עיין בטבלת החומרים); לקבלת קוד בסיסי להמחשת מסלול תנועת התולעת, ראה סעיף פרוטוק?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips