Extraction de phéromones sexuelles volatiles et test de chimioattraction chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Ce protocole établit des méthodes pour extraire et quantifier les réponses à la phéromone sexuelle volatile chez C. elegans, fournissant des outils pour étudier la communication chimique et la trajectoire de navigation.

Résumé

La communication chimique est vitale pour la santé de l’organisme, la reproduction et le bien-être général. La compréhension des voies moléculaires, des processus neuronaux et des calculs régissant ces signaux reste un domaine de recherche actif. Le nématode Caenorhabditis elegans fournit un modèle puissant pour étudier ces processus car il produit une phéromone sexuelle volatile. Cette phéromone est synthétisée par les femelles vierges ou les hermaphrodites appauvris en spermatozoïdes et sert d’attractif pour les mâles.

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour isoler la phéromone sexuelle volatile de plusieurs souches de C. elegans (souche WT N2, daf-22 et fog-2) et C. remanei. Nous fournissons également un protocole pour quantifier la réponse chimiotaxique masculine à la phéromone sexuelle volatile. Notre analyse utilise des mesures telles que l’indice de chimiotaxie (C.I.), le temps d’arrivée (A.T.) et un tracé de trajectoire pour comparer avec précision les réponses masculines dans diverses conditions. Cette méthode permet d’établir des comparaisons robustes entre des mâles de différents antécédents génétiques ou stades de développement. De plus, le dispositif expérimental décrit ici est adaptable à l’étude d’autres produits chimiques de chimioattraction.

Introduction

L’interaction entre la communication chimique et le succès de la reproduction est un principe fondamental dans le règne animal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Les phéromones sexuelles déclenchent un large éventail de comportements sexuellement dimorphes essentiels pour localiser les partenaires, coordonner les étapes impliquées dans la recherche et l’attraction d’un partenaire, et finalement favoriser la propagation d’une espèce 11,12,13,14,15,16,17. Des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension de la signalisation des phéromones, mais les mécanismes moléculaires, les circuits neuronaux et les processus informatiques régissant ces interactions restent souvent incomplètement définis 18,19,20,21,22,23,24,25,26.

Le nématode Caenorhabditis elegans fournit un modèle puissant pour disséquer ces questions. Notamment, C. elegans présente une stratégie de reproduction inhabituelle - les hermaphrodites peuvent s’autoféconder mais aussi se croiser avec les mâles 27,28,29,30,31,32,33. Cette flexibilité nécessite un système de communication robuste pour signaler l’état reproducteur. C. elegans est connu pour ses phéromones hydrosolubles bien caractérisées, les ascarosides, qui jouent des rôles variés dans le développement, le comportement et les interactions sociales. Des découvertes récentes ont révélé une classe distincte de phéromones sexuelles volatiles employées par les nématodes. Ces phéromones sont spécifiquement produites par les femelles vierges sexuellement matures de C. elegans et C. remanei et les hermaphrodites appauvris en spermatozoïdes, servant d’attractif pour les mâles adultes 29,34,35. Cet attractif présente un dimorphisme sexuel remarquable dans sa production et sa perception. La gonade somatique femelle régit la synthèse de cette phéromone sexuelle volatile, et la production reflète dynamiquement l’état reproducteur, cessant lors de l’accouplement et reprenant plusieurs heures plus tard^29,34.

Comprendre la communication des phéromones sexuelles des nématodes donne un aperçu de l’évolution des systèmes de communication chimique, de l’interaction entre l’état reproducteur et le comportement, et des mécanismes sous-jacents au traitement neuronal sexuellement dimorphe 24,26,36,37,38,39 . Des études impliquent que le neurone amphide AWA chez les mâles est essentiel pour la détection des phéromones, le récepteur couplé aux protéines G SRD-1 jouant un rôle clé dans la détection des phéromones chez les mâles²⁴. C. elegans est bien adapté à l’étude de la communication chimique animale, en particulier de la signalisation des phéromones sexuelles, en raison de sa dépendance au système olfactif pour la recherche de partenaire. Bien que l’on sache beaucoup de choses sur la signalisation des ascarosides, le système de phéromones sexuelles volatiles offre des possibilités uniques de comparaison 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50^,
51,52,53,54,55,56,57. De plus, C. elegans est un puissant organisme modèle génétique en raison de son génome entièrement séquencé, de sa lignée cellulaire clairement définie et de ses mutants olfactifs bien caractérisés.

Cependant, l’ensemble des circuits neuronaux impliqués dans le traitement de cette phéromone, les calculs qui traduisent sa perception en comportements ciblés de recherche de partenaire et la régulation de sa biosynthèse restent à élucider. Des recherches plus approfondies sur ces processus sont cruciales pour comprendre les divers mécanismes régissant la communication animale et les comportements reproductifs. L’identification de gènes clés impliqués dans la synthèse, la sécrétion et la perception des phéromones promet de dévoiler de nouveaux acteurs moléculaires dans la communication animale. Les analyses décrites ici fournissent une base pour répondre à ces questions.

Protocole

1. Extraction brute de phéromones sexuelles chez les femelles et les hermaphrodites

1. Protocole pour la synchronisation de C. elegans
   1. Préparation des femelles adultes ou hermaphrodites
      1. Surveiller quotidiennement les plaques de culture jusqu’à ce qu’il y ait une grande population de femelles adultes/hermaphrodites et que la source de nourriture OP50 s’épuise. À l’aide de femelles fog-2 C. elegans et WT C. remanei pour l’extraction brute des phéromones sexuelles, préparez des œufs synchronisés à partir des femelles accouplées.
         REMARQUE : Dans ce protocole, les animaux C . elegans fog-2 mutant XX, qui ne produisent pas d’auto-spermatozoïdes, sont appelés femelles C. elegans .
   2. Lavage et granulation des vers
      1. Laver les vers adultes d’une plaque de population mixte avec un tampon M9. Prélever la suspension de vis sans fin dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 1 500 × g pendant 0,5 à 1 min pour granuler les vers.
         REMARQUE : Prénettoyage pour une contamination importante (facultatif) : Laissez les vers se déposer dans le tube s’ils sont fortement contaminés. Pipetez le surnageant pour éliminer les bactéries et répétez l’opération jusqu’à ce qu’il devienne clair.
   3. Blanchiment
      1. Ajoutez 200 μL de tampon M9 à la pastille de ver. Préparez le tampon de lyse en mélangeant de l’eau de Javel domestique et 1 M de NaOH dans un rapport de 1:1. Ajoutez 500 μL de ce tampon de lyse au mélange, agitez le tourbillon pendant 10 s, puis faites une pause pour surveiller l’état de lyse à l’aide d’un microscope à dissection. Répétez ce processus de vortex de 10 s suivi d’une observation jusqu’à ce que les vers adultes soient complètement lysés.
   4. Arrêt du blanchiment et de la granulation des embryons
      1. Lorsque les vers adultes sont lysés en petits fragments (mais pas complètement dissous), ajoutez immédiatement 500 μL de tampon M9 pour ralentir la réaction. Centrifugeuse à 15 000 × g pendant 30 à 60 s pour granuler les embryons.
         REMARQUE : Une lyse excessive peut endommager les embryons. Arrêtez la réaction lorsque les corps des vers adultes se sont décomposés en petits fragments. La lyse se poursuit pendant les étapes de centrifugation et de lavage jusqu’à ce que tout le tampon de lyse soit éliminé.
   5. Lavez les embryons 5 fois avec 1 ml de tampon M9, en centrifugeant à 15 000 × g pendant 30 à 60 s après chaque lavage. Retirer le surnageant après centrifugation.
   6. Synchronisation
      1. Remettre les embryons en suspension dans 800 μL de tampon M9 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Faites pivoter le tube à 20 °C pendant 12 à 15 h pour l’éclosion de L1 et l’arrêt des vers au stade L1 en raison de l’absence d’alimentation alimentaire. Relâchez et cultivez les vers à 20° C pendant 3 jours jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4.

2. Extraction brute de phéromones sexuelles chez des femelles vierges d’un jour (figure 1A)

REMARQUE : Nous adoptons un protocole²⁴ précédemment établi pour extraire les phéromones sexuelles des femelles mutantes vierges fog-2 (féminisation de la lignée germinale) d’un jour de C. elegans et des femelles WT de C. remanei.

1. Préparation des femelles adultes
   1. Sélectionner et isoler environ 200 femelles de brouillard de stade L4 2 1 jour avant l’extraction des phéromones. Pour vous assurer que seules les femelles vierges sont recueillies, séparez soigneusement ces femelles L4 fog-2 par sexe et répartissez-les sur trois plaques distinctes OP50 NGM de 6 cm. Placez une petite quantité de bactéries OP50 au centre de chaque plaque.
      REMARQUE : Répartissez 200 vers femelles L4 sur trois plaques distinctes pour éviter le risque d’introduire accidentellement un ver mâle dans la plaque. Si un mâle est choisi, il est probable qu’il s’accouplera avec de nombreuses femelles, ce qui fait que la plupart des femelles sont fécondées le lendemain lorsqu’elles deviennent adultes. Les femelles fécondées n’émettent pas de phéromones sexuelles volatiles jusqu’à ce que les spermatozoïdes soient épuisés, ce qui affecte les résultats de l’extraction. La source de nourriture limitée restreint les hermaphrodites à une zone plus petite au centre de la plaque, minimisant ainsi les chances de s’échapper de la plaque pendant la période d’isolement.
2. Processus d’extraction
   1. Le jour de l’extraction (jour 1 de la maturité reproductive, 3 jours après que les vers ont été libérés de l’arrêt L1), prélever et isoler 100 femelles vierges de 1 jour dans un tube de microcentrifugation contenant 1 mL de tampon M9. Laver les femelles 5 fois avec un tampon M9 pour minimiser la contamination bactérienne et les incuber dans 100 μL de tampon M9 pendant 6 h à 20 °C pour permettre la production et l’accumulation de phéromones dans le milieu.
   2. Effectuer un processus d’extraction similaire pour les femelles de C. remanei , en utilisant seulement 15 à 20 femelles de stade L4 isolées la veille de l’extraction sur trois plaques, et le lendemain, incuber cinq femelles vierges dans 100 μL de tampon M9 pendant 6 h à 25 °C (température de croissance optimale pour C. remanei)⁵⁸.
      REMARQUE : Les femelles de C. remanei produisent une quantité plus élevée de phéromones sexuelles volatiles que les femelles de C. elegans . Par conséquent, seules cinq femelles suffisent pour extraire 100 μL de phéromone sexuelle volatile brute.
3. Stockage
   1. Centrifuger des échantillons à 15 000 × g pendant 30 à 60 s pour granuler les vers. Transférez soigneusement le surnageant (contenant des phéromones) dans un tube propre et jetez le tube contenant la pastille de ver. Conservez le surnageant isolé pour les tests de chimioattraction ultérieurs.
      REMARQUE : L’extrait brut de phéromones sexuelles volatiles peut être stocké pendant au moins 1 an à -80 °C dans un tube de microcentrifugation enveloppé de parafilm pour minimiser l’évaporation.
4. Contrôle qualité
   1. Avant d’utiliser l’extrait, effectuez un test de contrôle de la qualité avec des mâles N2 ou him-5 mâles pour vérifier son attractivité chimiologique (voir rubrique 4).

3. Une grande quantité d’extraction brute de phéromones sexuelles à partir d’hermaphrodites vierges âgés de 6 jours (Figure 1A)

1. Culture de vers
   1. Pour obtenir environ 20 ml de phéromone sexuelle brute de C. elegans , synchronisez vingt plaques NGM de 10 cm contenant des vers adultes sains de C. elegans (N2 ou mutant daf-22 ) en utilisant le protocole d’eau de Javel susmentionné, puis lavez-les 5 fois avec un tampon M9.
      REMARQUE : Ce processus prépare suffisamment d’embryons pour l’extraction de phéromones. N2 : La souche standard de WT C. elegans qui produit à la fois des phéromones ascarosides hydrosolubles et des phéromones sexuelles volatiles non ascarrosidiques. Mutant daf-22 : Un mutant n’ayant pas la capacité de produire de nombreuses phéromones ascarosides, ce qui les rend utiles pour étudier isolément les phéromones sexuelles volatiles non ascarrosidiques.
   2. Pour synchroniser les vers au stade L1, faites pivoter les embryons dans le tampon M9 pendant 12 à 15 h pour arrêter le développement. Transférez les vers L1 arrêtés dans des plaques de culture NGM de 10 cm ensemencées avec la bactérie OP50 pour la croissance et le développement.
   3. Pour minimiser la présence de mâles sur les plaques hermaphrodites, vérifiez les plaques 2 jours après la libération du vers, au stade L4, et retirez tous les mâles observés (très rare).
   4. Après trois jours de développement, recherchez l’apparition d’embryons indiquant que les vers sont devenus des adultes matures sur le plan reproductif.
      REMARQUE : les femelles mutantesfog-2 de C. elegans et les femelles WT de C. remanei ne conviennent pas à l’extraction de phéromones sexuelles volatiles en vrac. C. elegans et C. remanei ont une forte proportion de mâles dans leurs populations, et les mâles s’accouplent continuellement avec les femelles. Les femelles fécondées ne produisent pas de phéromones sexuelles volatiles. La présence masculine complique l’extraction de ces composés.
2. Lavage des vers et séparation des embryons
   1. Lavez les embryons à plusieurs reprises avec le tampon M9 et laissez-les se déposer (sédimentation de 1 g ) jusqu’à ce que la plupart des adultes soient au fond du tube ; Répétez l’opération 5 à 7 fois. Laissez les tubes de microcentrifugation se déposer sans être dérangés dans un rack pendant plusieurs minutes pour faciliter la sédimentation des vers adultes et permettre la séparation de la population de vers adultes des embryons, qui restent en suspension dans le surnageant.
   2. Pipeter les adultes séparés et les transférer dans de nouvelles plaques NGM ensemencées d’OP50.
   3. Répétez ce processus de lavage pendant 5 à 6 jours pour épuiser l’auto-sperme.
      REMARQUE : Pour l’extraction des phéromones sexuelles volatiles, utilisez des hermaphrodites âgés de 5 à 6 jours. Ce moment garantit que leur auto-spermatozoïde est susceptible d’être épuisé, car les hermaphrodites avec l’auto-spermatozoïde disponible ne produisent pas de phéromones sexuelles volatiles. De nombreux embryons morts ou non éclos sur la plaque au jour 5 ou 6 indiquent un moment approprié pour commencer l’extraction des phéromones.
3. Extraction de phéromones sexuelles
   1. Extraire la phéromone sexuelle comme décrit dans la rubrique 1 avec des modifications.
   2. Au lieu d’ajouter 100 femelles de C. elegans par 100 μL, ajoutez un tampon M9 en fonction du volume final de pastilles de ver. Ajouter 1 mL de tampon M9 par 50 μL de vers tassés.
4. Contrôle de la qualité et homogénéisation
   1. Lots d’essai de contrôle de la qualité de la phéromone extraite à l’aide du test de chimioattraction avec des mâles N2 ou him-5 mâles (voir rubrique 4).
   2. Mélangez tous les lots pour créer une phéromone sexuelle volatile brute homogène pour les expériences qui nécessitent une grande quantité de phéromones, telles que le criblage ou les expériences microfluidiques. Conservez l’extrait brut de phéromones sexuelles pendant au moins 1 an à -80 °C dans des tubes de 50 mL enveloppés de parafilm pour minimiser l’évaporation.
5. Méthode de titrage basée sur un test de chimioattraction pour la standardisation d’un extrait de phéromones sexuelles brutes
   1. Effectuez un test de titrage en testant des dilutions en série de chaque extrait de phéromones sur WT N2 et him-5 mâle C. elegans. Déterminer la dilution la plus élevée (concentration la plus faible) qui permet d’obtenir une réponse chimiotaxique robuste et reproductible dans les souches témoins.
   2. Préparez une série de dilutions de chaque extrait brut (p. ex., 1:2, 1:4, 1:8, etc.) dans un tampon M9.
   3. Dosages de chimiotaxie
      1. Effectuer des tests de chimiotaxie standardisés (voir rubrique 4) en utilisant chaque dilution sur la souche de référence des mâles. Effectuez trois répétitions pour garantir la reproductibilité. Comparez les dilutions optimales entre différents lots d’extraction pour évaluer la cohérence de la concentration en phéromones.
         REMARQUE : Cela établit un point de référence pour évaluer la bioactivité de chaque extrait. Dans le test standard de chimioattraction des phéromones sexuelles, les extraits non dilués originaux seront utilisés pour les expériences ultérieures, le titrage servant d’étape de contrôle de la qualité pour assurer une activité constante des phéromones entre les lots. La série de dilution peut être ajustée en fonction des besoins expérimentaux spécifiques. Étant donné que le protocole d’extraction standard produit systématiquement des extraits de phéromones brutes saturées, un test de titrage pour normaliser l’extrait peut ne pas être nécessaire pour la plupart des expériences. Il est recommandé d’utiliser le même lot de phéromones sexuelles brutes tout au long d’une série d’expériences connexes afin de maintenir l’uniformité et de minimiser la variabilité de l’activité des phéromones.

4. Test de chimioattraction des phéromones sexuelles volatiles

REMARQUE : Le test de chimioattraction des phéromones sexuelles volatiles a été adapté des méthodes précédemment établies utilisées dans d’autres études de chimioattraction 24,29,59,60,61. Ces modifications ont été mises en œuvre pour optimiser la sensibilité et la spécificité du test pour la détection des réponses aux phéromones sexuelles volatiles. Cette approche personnalisée améliore l’applicabilité du test à des besoins de recherche spécifiques.

1. Observez les plaques de culture quotidiennement jusqu’à ce que les femelles adultes/hermaphrodites soient abondantes. La santé des vers influence leur réponse à la phéromone sexuelle.
2. Préparation de lui-5 mâles
   1. Utilisez le protocole standard de bleach pour synchroniser les vers him-5 . Après la synchronisation, lavez les vers 5 fois avec le tampon M9. Isoler les mâles L4 la veille du dosage ; ensuite, transférez des vers mâles adultes d’un jour de leurs plaques ensemencées et rincez-les dans un tampon M9 avant le test. Placez-les sur des plaques NGM non ensemencées avant l’essai afin d’éliminer les bactéries résiduelles et d’éviter l’interférence des aliments pendant l’essai.
      REMARQUE : Ne laissez pas les vers affamés plus d’une heure avant le test, car cela peut modifier leur état interne et influencer les résultats du test de chimioattraction des phéromones sexuelles. Par conséquent, si vous avez l’intention d’effectuer plus de 10 tests en une seule journée, remplacez les échantillons de vers toutes les heures. De plus, alternez entre un essai expérimental et un essai de contrôle à plusieurs reprises.
3. Préparation des plaques de dosage de gélose à chimioattraction
   1. Préparer des plaques d’essai de chimioattraction avec 1,5 % de gélose, 25 mM de NaCl, 1,5 mM de Tris-base et 3,5 mM de Tris-Cl, comme décrit dans la littérature pertinente²⁴.
   2. Chauffer la gélose dans la solution de chimioattraction à l’aide d’un micro-ondes jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute. Laisser refroidir la solution à température ambiante pendant 5 min.
   3. À l’aide d’une pipette, répartissez uniformément la solution de gélose de chimioattraction dans des boîtes de Pétri : versez 30 ml dans chaque boîte de 10 cm et 20 ml dans chaque boîte de 6 cm.
   4. Après avoir versé la solution de gélose chimioattirée dans les boîtes de Pétri, laissez les couvercles ouverts dans un endroit propre pendant au moins 40 minutes pour permettre à la surface de la gélose de sécher légèrement. Une fois que la surface a bien séché, fermez les couvercles.
      REMARQUE : Ce temps de séchage peut varier en fonction de l’humidité et de la température de l’environnement du laboratoire.
4. Stockage des plaques et préparation du pré-dosage
   1. Emballez et conservez les plaques de dosage préparées dans une chambre froide jusqu’à 1 semaine. Avant utilisation, retirez les plaques de la chambre froide et laissez-les s’acclimater à la température ambiante pendant plus d’une heure. Ouvrez les couvercles pour laisser toute humidité résiduelle s’évaporer de la gélose 20 minutes avant le test dans un endroit propre, en vous assurant qu’il n’y a pas d’eau évidente à la surface avant de faire le test.
5. Conception expérimentale et test de chimioattraction
   1. Pour effectuer le test de chimioattraction, marquez trois points distincts sur le couvercle et le dessous de la boîte de Pétri ou utilisez un gabarit imprimé sur du papier plastique transparent placé sous la boîte ou fixé au microscope de dissection. Ces marques comprennent un point central (•) comme point de départ pour les vers, un signe plus (+) pour le point expérimental (2 μL de phéromone sexuelle sur le couvercle et 2 μL d’azoture de sodium 1 M sur la plaque) et un signe moins (-) pour le point de contrôle (2 μL de tampon M9 sur le couvercle et 2 μL d’azoture de sodium 1 M) (figure 2A). Ajustez la distance entre ces marques en fonction de la taille de l’antenne et des besoins expérimentaux spécifiques. En règle générale, pour les boîtes de Pétri de 6 cm, fixez une distance fixe de 1,5 cm entre le point de départ et chaque substance d’essai pour les tests de contrôle positif.
6. Étapes détaillées pour effectuer le test (Figure 2)
   1. Appliquer 2 μL d’azoture de sodium 1 M à chaque point d’expérimentation et de contrôle de la plaque.
   2. Choisissez 20 vers mâles en bonne santé et se déplaçant librement avec un ramasseur de vers. Relâchez simultanément 20 vers mâles au point de départ sous un microscope de dissection.
   3. Ajoutez rapidement 2 μL de phéromone sexuelle et 2 μL de tampon M9 aux points d’expérimentation et de contrôle sur le couvercle, respectivement.
   4. Fermez doucement le couvercle et placez la plaque de test dans un endroit calme et stable à la température à côté du microscope.
   5. Après 30 min, notez le test en comptant le nombre de vers à chaque endroit.
      REMARQUE : Le processus de cueillette de 20 vers ne doit pas dépasser 1 à 2 minutes pour éviter que les vers cueillis tôt ne se dessèchent et ne deviennent malsains, ce qui pourrait affecter les résultats. L’ensemble du processus, de la cueillette des mâles à la fermeture du couvercle, devrait prendre entre 2 et 5 minutes.
7. Dépistage de contrôle positif
   1. Testez les vers mâles dans une solution diluée de diacétyle 1 000 fois (dissoute dans de l’éthanol à 10 % et un tampon M9 à 90 %) pour confirmer leur réponse à la chimiotaxie. Évaluez les résultats du test de chimioattraction 30 minutes après le début du test. Évaluez les vers qui sont paralysés aux endroits désignés en fonction de leur emplacement : « C » pour ceux qui se trouvent au point de contrôle et « E » pour ceux qui se trouvent au point expérimental. Noter les vers à l’un ou l’autre endroit par « N » (figure 2C).
   2. Pour calculer l’indice de chimioattraction (IC), utilisez la formule suivante :
      
   3. Ne sélectionner que des échantillons mâles dont l’indice de chimiotaxie ≥ 0,4 (C.I., voir figure 2C). Utilisez le mâle du même lot pour le test de phéromone sexuelle suivant.
      REMARQUE : Effectuer trois essais distincts, chacun impliquant 20 vers, afin d’assurer l’uniformité et la fiabilité des résultats expérimentaux. Trois essais sont généralement suffisants pour inférer la cohérence.

5. Lignes directrices sur le moment et la notation pour le test de chimioattraction

1. Évaluez la réponse chimio-attraction des vers en fonction de leur emplacement final. Notez le nombre de vers à chaque endroit à la fin de l’essai, généralement 30 minutes après son début.
   REMARQUE : L’utilisation d’azoture de sodium aux points expérimentaux et de contrôle paralyse les vers qui arrivent, facilitant un marquage précis. La plupart des mâles WT N2 et him-5 sont capables de localiser la source de phéromones en 6 à 8 minutes dans une plaque de 6 cm avec une configuration de distance de 1,5 cm.
2. Pour détecter les défauts sur l’efficacité de la chimiotaxie, en particulier pour détecter les défauts subtils, envisagez de surveiller le test à intervalles réguliers de 3 à 5 minutes.
   REMARQUE : Cette observation fréquente permet de documenter les moments auxquels les vers arrivent aux points d’essai. Un suivi aussi détaillé peut révéler des cas où les vers présentent une efficacité chimiotaxique réduite tout en parvenant à atteindre le point de test dans la fenêtre d’examen.

6. Modifications facultatives

1. Pour une meilleure évaluation de la chimiotaxie, utilisez une caméra positionnée au-dessus de la plaque pour enregistrer les trajectoires des vers tout au long de l’essai.
   REMARQUE : Cette modification permet une analyse complète de leurs mouvements, ce qui permet de mieux comprendre le comportement et la trajectoire de la chimioattraction (Figure 3).

7. Analyse des données

1. Notation et calcul de l’indice de chimioattraction (C.I.)
   1. Suivez les étapes 4.7.1 et 4.7.2.
2. Graphique de l’heure d’arrivée
   1. Pour une analyse plus complète des essais de chimioattraction, envisagez de surveiller l’essai à des intervalles de 3 à 5 minutes ou d’utiliser une caméra placée au-dessus de la plaque pour enregistrer les trajectoires des vers tout au long de l’essai.
      REMARQUE : Ces approches permettent non seulement de noter les temps d’arrivée des vers aux points de conception, mais aussi de comparer les temps d’arrivée moyens et d’analyser la distribution de ces temps.
3. Analyse de trajectoire et visualisation de données par vidéo
   REMARQUE : Pour analyser les schémas de mouvement de C. elegans Lors des essais de chimioattraction, consignez et extrayez les trajectoires (voir le Table des matériaux) et une analyse plus poussée (Graphique 3).
   1. Configurez le système d’enregistrement.
   2. Lancez un nouvel enregistrement et accédez à la fenêtre des paramètres d’enregistrement .
   3. Définissez les paramètres d’enregistrement souhaités :
      1. Préfixe de fichier : choisissez un nom descriptif pour les fichiers vidéo (par exemple, « experiment1_ »).
      2. Fréquence d’images (FPS) : Sélectionnez les images par seconde appropriées pour capturer le mouvement du ver (par exemple, 7,5 FPS pour les vers sur la plaque de gélose et 30 FPS pour les vers nageurs ).
      3. Durée : Réglez la durée de l’enregistrement en secondes (par exemple, 1 800 s [30 min] pour le test de chimioattraction en vrac).
   4. Optimisez la qualité de l’image : ajustez l’intensité de l’éclairage pour vous assurer que les vers sont clairement visibles sur l’arrière-plan et affinez la mise au point pour obtenir une image nette des vers.
   5. Pour préparer la plaque de test, versez d’abord la solution de contrôle sur le point de contrôle désigné. Ensuite, ramassez soigneusement le(s) ver(s) et relâchez-les doucement au centre de la plaque. Une fois que le ou les vers se sont installés, appliquez la solution de phéromones sexuelles à l’endroit expérimental désigné.
   6. Positionnez la plaque : Placez soigneusement la plaque contenant les vers au centre du champ d’enregistrement pour maximiser la zone de capture.
   7. Pour réduire le stress sur les vers pendant les tests de chimiotaxie, envisagez les deux approches suivantes.
      1. Pour un test à un seul ver, placez le ver sur la plaque de test et laissez-le s’acclimater pendant 5 minutes avant d’introduire la solution de phéromones sexuelles à la distance désignée (la position basée sur l’emplacement actuel du ver).
         REMARQUE : Cela minimise la manipulation et donne au ver le temps de s’adapter à son nouvel environnement.
      2. Test de chimioattraction en vrac : Laisser les vers se déposer et se disperser naturellement sur la plaque pendant 5 min. Après cette période d’acclimatation, introduisez la solution de phéromones à la position fixe désignée. Au cours de l’analyse post-vidéo, mesurez la distance de départ de chaque ver par rapport à la phéromone et regroupez-les en conséquence pour une analyse plus approfondie.
   8. Procédure d’analyse vidéo
      1. Importation et configuration : importez la vidéo enregistrée dans le logiciel. Configurer les informations de séquence (par exemple, la fréquence d’images) ; Spécifiez l’échelle d’imagerie (pixels par unité de mesure).
      2. Réglage de l’image : pour optimiser la détection des vers, ajustez le seuil de détection jusqu’à ce que l’étiquette verte délimite étroitement les vers sans capturer le bruit de fond ou les artefacts. De plus, appliquez des algorithmes de lissage de l’arrière-plan pour réduire le bruit et les irrégularités de l’image, améliorant ainsi le contraste entre les vers et l’arrière-plan. Expérimentez avec différents niveaux de lissage pour trouver l’équilibre optimal entre la réduction du bruit et la préservation des détails des vers.
         REMARQUE : Le seuil idéal doit couvrir la majeure partie du corps de chaque ver tout en excluant les éléments étrangers.
      3. Optimisation des paramètres de détection : sélectionnez un ver représentatif pour générer automatiquement les paramètres de détection. Vérifiez la précision de la détection en inspectant visuellement 5 à 10 trames aléatoires. Si la détection n’est pas satisfaisante, affinez les paramètres de détection manuellement, réexaminez les paramètres de réglage de l’image si nécessaire et procédez au suivi une fois que la détection est fiable.
      4. Relecture et réparation des trajectoires de suivi : Une fois le processus de suivi automatisé terminé, effectuez une relecture manuelle des trajectoires générées. Si des incohérences sont détectées lors de la relecture, utilisez la fonction de réparation pour corriger la trajectoire et effectuez les opérations suivantes : Joindre : connectez des segments de trajectoire qui ont été attribués à tort à des identifiants différents, mais qui appartiennent à la même personne. Fractionner : séparez les segments de trajectoire qui ont été attribués de manière incorrecte au même identifiant, mais qui appartiennent à des individus différents.
         REMARQUE : L’objectif est de s’assurer que chaque identificateur unique (numéro) est attribué de manière cohérente à la même personne tout au long de la période de suivi.
         Exemple : Si un ver est étiqueté « 3 » pendant une période, puis incorrectement étiqueté « 7 » pour une période ultérieure, la fonction de réparation joindra ces deux segments sous l’identificateur « 3 ». À l’inverse, si deux vers sont tous deux étiquetés comme « 12 » pendant une période, la fonction de réparation divisera ce segment en deux trajectoires distinctes, chacune avec un identifiant unique. En relisant attentivement et en appliquant les réparations nécessaires, la précision et la fiabilité des données de suivi peuvent être considérablement améliorées.
      5. Visualisation et exportation des résultats : utilisez un logiciel pour la visualisation et l’analyse de base. Exportez les données sous forme de fichiers CSV pour une analyse plus approfondie avec les outils ou le code préférés. Cette méthode fournit un code de base (voir https://github.com/edmondztt/pheromone-traj-analysis.git) pour visualiser la trajectoire du mouvement du ver en fonction de cinq paramètres clés (Figure 3). Temps : La progression de la trajectoire, codée par couleur pour indiquer le passage du temps depuis le début de l’expérience. Distance jusqu’à la phéromone : La distance entre le ver et la source de phéromones à chaque point temporel. Vitesse : La vitesse du ver à chaque point, qui indiquait également les événements de virage et d’arrêt. Rectitude : À quel point la trajectoire du ver est droite. Exactitude de la direction : Dans quelle mesure le mouvement du ver est-il aligné avec la direction de la cible de la phéromone ? Ce code fournit une visualisation de base pour comprendre le comportement des vers et peut être personnalisé et étendu pour une analyse plus approfondie.
         REMARQUE : Cette approche avancée offre une alternative complète à l’indice de chimioattraction traditionnel en détaillant la trajectoire de navigation du ver en réponse aux phéromones sexuelles. Il permet de comprendre les modèles de mouvement sans s’appuyer sur des points finaux arbitraires de la navigation et de la détermination de la fenêtre temporelle, offrant ainsi des informations plus approfondies sur la dynamique comportementale du test. La moyenne des données a été calculée sur 20 images, qui peuvent être ajustées en fonction des besoins expérimentaux spécifiques, afin d’éliminer les mouvements causés par la torsion du corps.

Résultats

Analyse de trajectoire de la perception des phéromones sexuelles volatiles : souche défectueuse dans le test de chimioattraction
Ce test de chimioattraction différencie de manière fiable les souches de type sauvage et mutantes de C. elegans dans leur réponse aux phéromones sexuelles volatiles. Les expériences réussies avec les mâles him-5 démontrent systématiquement une chimiotaxie robuste envers la source de phéromones. Cela se traduit p...

Discussion

Ce protocole fournit une méthodologie robuste pour l’extraction des phéromones sexuelles volatiles de C. elegans, ainsi que l’établissement d’un test de chimioattraction robuste pour mesurer les réponses de chimioattraction masculine. Des informations supplémentaires peuvent être trouvées dans le guide d’utilisation de WormLab (voir la table des matériaux) ; Pour un code de base permettant de visualiser la trajectoire du mouvement du ver, reporte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips