Extração de feromônios sexuais voláteis e ensaio de quimioatração em Caenorhabditis elegans

Resumo

Este protocolo estabelece métodos para extrair e quantificar as respostas ao feromônio sexual volátil em C. elegans, fornecendo ferramentas para estudar a comunicação química e a trajetória de navegação.

Resumo

A comunicação química é vital para a saúde do organismo, a reprodução e o bem-estar geral. Compreender as vias moleculares, os processos neurais e os cálculos que regem esses sinais continua sendo uma área ativa de pesquisa. O nematóide Caenorhabditis elegans fornece um modelo poderoso para estudar esses processos, pois produz um feromônio sexual volátil. Este feromônio é sintetizado por fêmeas virgens ou hermafroditas empobrecidos em esperma e serve como atrativo para os machos.

Este protocolo descreve um método detalhado para isolar o feromônio sexual volátil de várias cepas de C. elegans (WT cepa N2, daf-22 e fog-2) e C. remanei. Também fornecemos um protocolo para quantificar a resposta da quimiotaxia masculina ao feromônio sexual volátil. Nossa análise utiliza medições como índice de quimiotaxia (CI), tempo de chegada (AT) e um gráfico de trajetória para comparar as respostas masculinas sob várias condições com precisão. Este método permite comparações robustas entre machos de diferentes origens genéticas ou estágios de desenvolvimento. Além disso, a configuração experimental descrita aqui é adaptável à investigação de outros produtos químicos de quimioatração.

Introdução

A interação entre a comunicação química e o sucesso reprodutivo é um princípio fundamental em todo o reino animal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Os feromônios sexuais desencadeiam uma ampla gama de comportamentos sexualmente dimórficos essenciais para localizar parceiros, coordenar as etapas envolvidas na busca....

Protocolo

1. Extração bruta de feromônios sexuais de fêmeas e hermafroditas

1. Protocolo para sincronização de C. elegans
   1. Preparação de fêmeas adultas ou hermafroditas
      1. Monitore as placas de cultura diariamente até que exista uma grande população de fêmeas adultas/hermafroditas e a fonte de alimento OP50 se esgote. Usando fêmeas de C. elegans e WT C. remanei para extração de feromônio sexual bruto, prepare ovos sincronizados das fêmeas acasaladas.
         NOTA: Neste protocolo, os animais XX mutantes de C. elegans fog-2 , que não produzem espermatozóides, são chamados de f....

Discussão

Este protocolo fornece uma metodologia robusta para a extração de feromônios sexuais voláteis de C. elegans, juntamente com o estabelecimento de um ensaio robusto de quimioatração para medir as respostas de quimioatração masculina. Informações adicionais podem ser encontradas no guia do usuário do WormLab (consulte a Tabela de Materiais); Para obter um código básico para visualizar a trajetória do movimento do worm, consulte a seção 7.3.8.5 do pr.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dishes	Falcon	25373-100	Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes	Falcon	25373-085	Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464)	CGC
Centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418	Any brand should work.
Chemoattraction assay plates	Homemade solution	N/A	1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol	Alfa Aesar	57-88-5
Dissecting Microscope	Leica	LeicaMZ75	Any brand should work.
E. Coli OP50	CGC
Ethanol	Koptec	64-17-5
fog-2(q71) (JK574)	CGC
him-5(e1490)(CB4088)	CGC
Household bleach	Clorox Germicidal bleach concentrated		Bleach
M9 buffer	Homemade solution	N/A	3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder	Macron	M1063-500GM-EA
Microwave	TOSHIBA	N/A	Any brand should work.
N2	CGC
NaOH	Sigma-aldrich	S318-3	1 M
NGM plates solution	Homemade solution	N/A	2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm	Bemis	13-374-10	Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone	VWR	97063-324
Pipet- aid	Drummond Scientific	4-000-100	Any brand should work.
Plastic paper	Octago	Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film	https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride	Sigma-aldrich	SLBP2366V
Potassium phosphate	Spectrum	7778-77-0
Pipette	Eppendorf	SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006	20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, any brand should work.
Rotator	Labnet	SKU: LI-H5500	Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride	VWR	7647-14-5
sodium phosphate dibasic	Sigma-aldrich	SLCG3888
Tris-base	Sigma-aldrich	77-86-1
Tris-Cl	Roche	1185-53-1
Tryptone	VWR	97063-390
Vortex	Scientific industries	Vortex-Genie 2	Any brand should work.
WormLab system	MBF Bioscience	N/A	https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker	Homemade	N/A	made with platinum and glass pipet tips