A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف هذا البروتوكول إجراء لأخذ عينات من شبكية الفئران واستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين ومقايسة TUNEL واللطخة الغربية للكشف عن التغيرات المرضية وموت الخلايا المبرمج في شبكية العين بعد الحقن داخل الصفاق ل N-Methyl-N-Nitrosourea.
يمكن ملاحظة اعتلال الشبكية في معظم أمراض العين والمضاعفات المتأخرة لمرض السكري. تعد الخلايا الظهارية الصبغية المحددة وتلف الخلايا البصرية وتنكسها من السمات الرئيسية لاعتلال الشبكية. أظهرت العديد من الأدوية التقليدية فعالية سريرية كبيرة في علاج اعتلال الشبكية. تعد كيفية الحصول على شبكية العين بسرعة وبشكل كامل خطوة أساسية في أبحاث الطب التقليدي لعلاج اعتلال الشبكية. في هذه الدراسة ، نهدف إلى توفير إجراء موحد وقابل للممارسة لأخذ عينات من تلف شبكية العين الناجم عن N-methyl-N-nitrosourea (MNU) والتقييم متعدد المؤشرات للتغيرات المرضية. تم حقن الفئران داخل الصفاق ب 60 مجم / كجم MNU مرة واحدة للحث على تلف شبكية العين ، وتم الحصول على عينات شبكية العين بعد 7 أيام. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين لتقييم التغيرات المرضية في الشبكية. تحديد معدل موت الخلايا المبرمج وبروتين موت الخلايا المبرمج بواسطة TUNEL و Western blot. تساعد هذه البروتوكولات الموحدة لأخذ عينات الشبكية وتقييم التغيرات المرضية في تعزيز استكشاف آلية اعتلال الشبكية واكتشاف أعشاب تقليدية جديدة وفعالة.
التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو مرض وراثي ومسبب للعمى فيالشبكية 1. يتراوح معدل الإصابة ب RP بين 1/3500 و 1/5000 ، مما يؤثر على الوظيفة البصرية لحوالي 2.5 مليون شخص في العالم. إنه من أكثر الأمراض شهرة التي تؤدي إلى ضعف البصر لدى الإنسان ، مما يفرض عبئا كبيرا على المجتمع بأسره2. يتميز المرض بالفقدان التدريجي لوظيفة الخلايا الظهارية الصبغية في الشبكية وموت الخلايا المبرمج التدريجي للمستقبلات الضوئية. في المرحلة المبكرة ، يعاني المرضى من العمى الليلي ، والذي يتجلى في عيوب المجال البصري المحيطي ويؤدي في النهاية إلى فقدان الرؤية المركزية3. لذلك ، فإن تثبيط موت الخلايا المبرمج لمستقبلات ضوء الشبكية هو نقطة للوقاية والعلاج من RP.
موت الخلايا المبرمج لخلايا الشبكية هو سمة شائعة للحيوانات النموذجية النموذجية4. يمكن أن يؤدي الحقن داخل الصفاق ل 60 مجم / كجم N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) في الفئران لمدة 7 أيام إلى موت الخلايا المبرمج وفقدان الخلايا المستقبلة للضوء في الشبكية ، وهو نموذج حيواني شائع الاستخدام ل RP5،6. يمكن أن يوفر تحليل التغيرات في التركيب المرضي ، وموت الخلايا المبرمج للخلايا المحددة ، والتعبير البروتيني المرتبط بموت الخلايا المبرمج لأنسجة الشبكية في النموذجية بيانات تجريبية فعالة ودعما نظريا في دراسة التسبب في RP البشري وأدويةالفحص 7،8. لذلك ، تحدد جودة عينات الشبكية موثوقية البيانات التجريبية. ومع ذلك ، نظرا لخصوصية أنسجة العين ، هناك عدد قليل جدا من التقارير حول كيفية الحصول على شبكية العين9.
توفر هذه الورقة إجراء بسيطا وسريعا وموحدا وقابلا للتشغيل لأخذ عينات الشبكية في الفئران للتغلب على أوجه القصور المذكورة أعلاه. يتم استخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين - اليوزين (HE) ، وتلوين ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي بوساطة ديوكسيوريال ثلاثي فوسفات - ديجوكسيجينين (TUNEL) ، واللطخة الغربية لتحليل التغيرات المرضية في تلف أنسجة الشبكية وموت الخلايا المبرمج في الفئران. جميع الأساليب مستمدة من خبرة مجموعتنا البحثية مع العمليات التشغيلية المحددة.
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات الجراحية من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة نينغشيا الطبية (رقم الأخلاقيات: رقم 2020-Q066). تم شراء ذكور الفئران SPF Sprauge-Dawley (SD) ، التي تتراوح أعمارها بين 7 و 8 أسابيع ووزنها 200-220 جم ، من جامعة نينغشيا الطبية برقم ترخيص SCXK (Ning) 2020-0001. تم تربية جميع في مركز المختبر بجامعة نينغشيا الطبية. كانت درجة الحرارة والرطوبة مناسبتين ، وتم الحفاظ على دورة الضوء ليلا ونهارا ، وكان الطعام والماء مجانيين وكافيين.
1. التحضير قبل الجراحة
2. أخذ عينات الشبكية للكشف عن عامل البروتين
3. أخذ عينات الشبكية للفحص المرضي وتلوين الخلايا المحددة
4. تلطيخ شبكية العين الفئران
5. تحديد معدل موت الخلايا المبرمج لخلايا مستقبلات ضوء الشبكية بطريقة TUNEL
6. تحليل اللطخة الغربية 10
7. التحليل الإحصائي
بعد تلطيخ HE ، كان لجميع طبقات شبكية الفئران في المجموعة الضابطة بنية نسيجية واضحة ، وترتيب خلوي منظم ، وتلوين موحد ، في حين أن بنية شبكية الفئران في المجموعة النموذجية تضررت بشكل كبير ، وكانت طبقة الشبكية الخارجية أرق ، وتم دمج الطبقة النووية الخارجية بالكامل تقريبا مع ا...
RP هو مرض شائع في الشبكية في العيادات. ترتبط بداية وشدة وتطور RP بالجينات والأنماط الجينية وتتأثر بالبيئة8،11. يشمل RP RP العائلي و RP العرضي ، حيث يمثل RP العائلي حوالي 60٪ من المرضى. من خلال تتبع التاريخ الجيني للعائلة ، تم تحديد 83 جينا مرتبطا ب RP ?...
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع البحث العلمي التابع لإدارة التعليم العالي في نينغشيا (NYG2022029).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Imager | GE | 680 | |
Ammonium persulfate | Boster Biological Technology Co.,Ltd | A8090 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | ME104E | |
BCA protein quantization kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP902 | |
cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | #9664 | |
cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | #8438 | |
cleaved caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | #9507 | |
DeadEnd Fluorometric TUNEL System | Promega | G3250 | |
Glycine | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1200 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Bioss Antibodies | bs-80295G-HRP | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
High speed crusher | Thermo Fisher Scientific | AG22331 | |
Immobilon-P SQ Transfer membranes | Merck Millipore. Ltd | ISEQ00010 | |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22-10 | |
Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific | 1510 | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
Mini-PROTEAN Tetra | BIO-RAD | 1658001 | |
N-Methyl-N-Nitrosourea | sigma-Aldrich | N4766–100G | |
Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
Page Pre-solution (30% ) | Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd | L3202A | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26617 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×) | Beyotime Biotechnology | P0015 | |
Skim milk powder | BioFroxx | 1172GR500 | |
Sprague Dawley rats | Ningxia Medical University | SCXK (Ning) 2020-0001 | |
TEMED | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1165 | |
Total protein extraction kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP2100 | |
Trans-Blot Module | BIO-RAD | 1703935 | |
Tris base | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1162 | |
Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved