Échantillonnage des lésions rétiniennes induites par le N-méthyl-N-nitrosourea chez le rat et évaluation multi-indices des changements pathologiques

Résumé

Ce protocole décrit une procédure d’échantillonnage de la rétine chez le rat et l’utilisation de la coloration à l’hématoxyline-éosine, du dosage TUNEL et du transfert Western pour détecter les changements pathologiques et l’apoptose dans la rétine après l’injection intrapéritonéale de N-méthyl-N-nitrosourea.

Résumé

La rétinopathie peut être observée dans la plupart des maladies oculaires et les complications tardives du diabète sucré. Les cellules épithéliales pigmentaires spécifiques et les dommages et la dégénérescence des cellules optiques sont les principales caractéristiques de la rétinopathie. De nombreuses médecines traditionnelles ont montré une efficacité clinique substantielle dans le traitement de la rétinopathie. Comment obtenir une rétine rapidement et complètement est une étape clé dans la recherche en médecine traditionnelle pour le traitement de la rétinopathie. Dans cette étude, nous visons à fournir une procédure standardisée et exerçable pour l’échantillonnage des lésions de la rétine induites par la N-méthyl-N-nitrosourée (MNU) chez le rat et l’évaluation multi-indices des changements pathologiques. Des rats ont reçu une injection intrapéritonéale de 60 mg/kg de MNU pour induire des lésions de la rétine, et des échantillons de rétine ont été obtenus après 7 jours. De plus, nous avons effectué une coloration à l’hématoxyline-éosine pour évaluer les changements pathologiques rétiniens. Détermination du taux d’apoptose et de la protéine d’apoptose par TUNEL et Western blot. Ces protocoles normalisés pour l’échantillonnage de la rétine et l’évaluation des changements pathologiques sont utiles pour promouvoir l’exploration du mécanisme de la rétinopathie et la découverte de plantes traditionnelles nouvelles et efficaces.

Introduction

La rétinite pigmentaire (RP) est une maladie rétinienne héréditaire et cécitante¹. L’incidence de la RP est comprise entre 1/3500 et 1/5000, affectant la fonction visuelle d’environ 2,5 millions de personnes dans le monde. C’est l’une des maladies les plus connues entraînant une déficience visuelle chez l’être humain, imposant un fardeau important à l’ensemble de la société². La maladie se caractérise par la perte progressive de la fonction des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes et l’apoptose progressive des photorécepteurs. Au stade précoce, les patients présentent une cécité nocturne, qui se manifeste par des anomalies du champ visuel périphérique et conduit finalement à la perte de la vision centrale³. Par conséquent, l’inhibition de l’apoptose des photorécepteurs rétiniens est le point de repère pour la prévention et le traitement de la RP.

L’apoptose des cellules rétiniennes est une caractéristique commune de la RP humaine et des animaux modèles⁴. L’injection intrapéritonéale de 60 mg/kg de N-méthyl-N-nitrosourée (MNU) chez le rat pendant 7 jours peut induire l’apoptose et la perte de cellules photoréceptrices rétiniennes, et il s’agit d’un modèle animal couramment utilisé de RP ^5,6. L’analyse des changements dans la structure pathologique, l’apoptose cellulaire spécifique et l’expression protéique liée à l’apoptose du tissu rétinien chez les animaux modèles peut fournir des données expérimentales efficaces et un soutien théorique dans l’étude de la pathogenèse de la RP humaine et le dépistage des médicaments ^7,8. Par conséquent, la qualité des échantillons rétiniens détermine la fiabilité des données expérimentales. Cependant, en raison de la particularité du tissu oculaire, il existe très peu de rapports sur la façon d’obtenir la rétine du rat⁹.

Cet article fournit une procédure simple, rapide, standardisée et utilisable pour l’échantillonnage de la rétine chez le rat afin de surmonter les lacunes ci-dessus. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE), la coloration terminale à la désoxyuridine triphosphate-digoxigénine médiée par la désoxyuridine triphosphate-digoxigénine (TUNEL) et la coloration Western blot sont utilisées pour analyser les changements pathologiques dans les lésions tissulaires rétiniennes et l’apoptose chez les rats. Toutes les méthodes sont dérivées de l’expérience de notre groupe de recherche avec les processus opérationnels spécifiques.

Protocole

Tous les protocoles et procédures chirurgicales ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université de médecine du Ningxia (numéro d’éthique : N° 2020-Q066). Des rats mâles SPF Sprauge-Dawley (SD), âgés de 7 à 8 semaines et pesant de 200 à 220 g, ont été achetés à l’Université de médecine du Ningxia avec le numéro d’homologation d’animal SCXK (Ning) 2020-0001. Tous les animaux ont été élevés dans le Centre des animaux de laboratoire de l’Université de médecine du Ningxia. La température et l’humidité étaient appropriées, le cycle de lumière jour-nuit était maintenu et la nourriture et l’eau étaient gratuites et suffisantes.

1. Préparation préopératoire

1. Préparation des matériaux
   1. Préparez des plaques pour rats, des appareils d’anesthésie par inhalation, des boîtes intégrées, des tubes de stockage congelés, des gants et des masques chirurgicaux jetables, des flacons à large ouverture, du paraformaldéhyde à 4 %, des blocs réfrigérants, des ciseaux ophtalmiques, des pinces à épiler ophtalmiques, des lames chirurgicales et des manches de couteau, des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et stérilisez-les à l’avance (voir le tableau des matériaux).
2. Préparation des animaux
   1. Divisez au hasard 20 rats SD mâles en groupe modèle (n = 10) et groupe témoin (n = 10). Injecter chez des rats modèles par voie intrapéritonéale avec 60 mg/kg de MNU et injecter chez des rats témoins par voie intrapéritonéale le même volume de solution saline.
   2. Après 7 jours d’injection, faites jeûner les rats et laissez-les boire librement la veille de l’échantillonnage.
   3. Le lendemain, placez le rat en décubitus dorsal sur la table d’opération et utilisez un masque pour administrer une anesthésie à 4 % d’isoflurane et 2 L/min d’oxygène. Mesurez la profondeur de l’anesthésie en pinçant le centre du pied pour observer les réactions des rats.

2. Prélèvement rétinien pour la détection du facteur protéique

1. Fixez l’orbite du rat avec la main gauche et retirez l’œil avec une force modérée avec la main droite à l’aide d’une pince à flexion ophtalmique. Placez le globe oculaire en position sagittale dans un plat en verre froid.
2. Avec la main gauche tenant une pince à épiler ophtalmique droite pour fixer le globe oculaire et la main droite tenant la lame chirurgicale, faites une incision longitudinale de 2 mm près du site du cristallin.
3. Coupez la cornée avec les ciseaux ophtalmiques le long de l’incision et décollez doucement le cristallin, le vitré et exposez l’œilleton.
4. Placez le bas de l’œilleton à l’extrémité du tube de microcentrifugation de 1,5 ml, tournez l’œilleton sur le tube et exposez la rétine (la rétine est jaune pâle).
5. Retirez toute la rétine le long de la paroi sclérale du globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler ophtalmique, puis placez-la dans un tube congelé et rangez-la dans un réservoir d’azote liquide pour une utilisation future (Figure 1).

3. Prélèvement rétinien pour l’examen pathologique et la coloration cellulaire spécifique

1. Avec la main gauche, utilisez la pince à épiler pour soulever le coin de l’œil du rat. Avec la main droite, utilisez une lame chirurgicale pour découper une ouverture de 4 mm le long du coin de l’œil du rat.
2. Utilisez la pince à épiler pour serrer le bord du globe oculaire au niveau de l’ouverture de la main gauche. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper les tissus environnants le long du bord du globe oculaire tout en faisant attention au nettoyage des tissus environnants du globe oculaire.
3. Séparez les tissus autour du nerf optique au pôle postérieur du globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler, coupez le nerf optique et faites attention à le préserver. Ensuite, retirez le globe oculaire.
4. Lavez le globe oculaire retiré dans une solution saline pour éliminer tout sang restant, roulez-le sur du papier filtre pour absorber l’excès d’eau et placez-le sur du papier d’aluminium froid.
5. Fixez l’œil avec une pince à épiler ophtalmique. Faites une incision longitudinale de 4 mm le long de la jonction de la cornée et de la rétine à l’aide d’une lame chirurgicale.
6. Retirez la cornée avec des ciseaux ophtalmiques, faites une coupe circulaire le long de l’incision et retirez doucement le cristallin et le corps vitré.
7. Placez l’œilleton restant avec un nerf optique dans une boîte d’enrobage et fixez-le dans du paraformaldéhyde à 4 %.
8. Incorporez des échantillons fixés au paraformaldéhyde dans de la paraffine et coupez-les en tranches de 4 μm pour la coloration HE et la coloration TUNEL⁷.

4. Coloration HE de la rétine du rat

1. Déparaffinage et hydratation : Placez les tranches dans du xylène pendant 10 min, répétez le processus pendant encore 10 min, suivi de l’éthanol absolu pendant 5 min, répétez le traitement à l’éthanol pendant encore 5 min, suivi d’un traitement à 95 % d’alcool pendant 5 min, puis à 85 % d’alcool pendant 5 min, et enfin à 75 % d’alcool pendant 5 min.
2. Coloration à l’hématoxyline : Rincer la tranche à l’eau déminéralisée pendant 5 min. Utilisez 100 μL de solution de coloration à l’hématoxyline et colorez pendant 5 min, rincez à l’eau désionisée pendant 5 à 10 s. Ajouter 100 μL d’éthanol à 1 % d’acide chlorhydrique pendant 30 s, rincer à l’eau désionisée pendant 20 min et ajouter 100 μL d’eau ammoniacale à 0,2 % pendant 1 min. Rincer à l’eau déminéralisée pendant 5 min.
3. Coloration à l’éosine : Utiliser 100 μL de solution de coloration à l’éosine pour colorer pendant 5 minutes et rincer à l’eau déminéralisée pendant 30 s.
4. Déshydratation et scellement : Plongez les tranches dans de l’alcool à 70 % pendant 5 min, puis à 85 % d’alcool pendant 5 min, puis à 90 % d’alcool pendant 5 min et de l’éthanol absolu pendant 5 min. Répétez le traitement à l’éthanol absolu pendant encore 5 minutes, puis immergez-le dans le xylène pendant 5 minutes et répétez le processus pendant encore 5 minutes. Enfin, scellez en ajoutant environ 100 μL de résine neutre à la surface des tranches, puis couvrez-la d’un verre de protection.
5. Imagerie des lames : Positionnez les tranches colorées sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que l’image soit clairement visible, réglez le grossissement à 400x et capturez l’image.
6. Mesurer l’épaisseur totale de la rétine et l’épaisseur externe de la rétine : Mesurez l’épaisseur totale de la rétine et l’épaisseur externe de la rétine (épaisseur de la couche nucléaire externe et de la couche photoréceptrice) et calculez le pourcentage d’épaisseur externe de la rétine
   Épaisseur externe de la rétine ( %) = (épaisseur externe de la rétine/épaisseur totale de la rétine) x 100.

5. Détermination du taux d’apoptose des cellules photoréceptrices rétiniennes avec la méthode TUNEL

1. Déparaffinage et hydratation : Placez les tranches dans du xylène pendant 10 min, répétez le processus pendant encore 10 min, puis placez-les dans de l’éthanol absolu pendant 5 min, et répétez cette étape pendant encore 5 min. Effectuez la déshydratation en plaçant dans de l’alcool à 95 % pendant 5 min, de l’alcool à 90 % pendant 5 min, de l’alcool à 80 % pendant 5 min, de l’alcool à 70 % pendant 5 min et rincez à l’eau déminéralisée pendant 5 min.
2. Rincer avec une solution de chlorure de sodium à 0,85 % pendant 5 min et du PBS pendant 5 min. Fixer avec du paraformaldéhyde en utilisant 4 % de paraformaldéhyde pendant 15 min. Rincez avec du PBS pendant 5 minutes et répétez l’opération pendant 5 minutes supplémentaires.
3. Incubation et équilibre⁷ : Incuber avec une solution de protéinase K de 20 μg/mL pour la digestion pendant 15 min, équilibrer dans le tampon d’équilibre pendant 10 min et incuber avec un tampon de désoxynucléotidyltransférase terminale recombinante (rTdT) à 37 °C pendant 60 min.
4. Arrêt de la réaction : Ajouter 100 μL de la solution étalon de citrate (2 solutions SSC) pendant 15 min. Rincez avec du PBS pendant 5 minutes et répétez l’opération pendant 5 minutes supplémentaires.
5. Colorant nucléaire : Ajouter 100 μL de réactif 4 ′, 6-diamidine-2-phenindl (DAPI) pendant 5 min. Lavez à l’eau déminéralisée pendant 5 minutes et répétez le processus pendant encore 5 minutes.
6. Sceller : Essuyez l’excès de xylène autour des tranches et scellez-les en ajoutant environ 100 μL de résine neutre à la surface des tranches, puis couvrez-la d’un verre de protection.
7. Microscopie : placez les tranches colorées sur le microscope, ajustez la mise au point du microscope pour une visibilité claire, réglez le grossissement sur 400x et capturez l’image. Observez la fluorescence verte à 520 ± 20 nm à l’aide d’un filtre de fluorescence standard. Observez le DAPI bleu à 460 nm.
8. Calculer le taux d’apoptose : mesurer les valeurs de fluorescence verte et les valeurs de fluorescence bleue de la couche externe du noyau rétinien. Calculer le taux d’apoptose comme suit :
   Taux de cellules d’apoptose = valeur de fluorescence verte/valeur de fluorescence bleue x 100.

6. Analyse par transfert Western ¹⁰

1. Traitement par tampon de lyse : Hacher et homogénéiser une rétine congelée avec 50 μL de tampon de lyse à froid (1 mL de tampon de lyse contenant 5 μL d’inhibiteur de phosphatase, 1 μL d’inhibiteur de protéase et 5 μL de 100 mM de PMSF).
2. Soumis à une sonication de 28 kHz pendant 5 s sur un bain de glace ; Répétez 3 fois. Centrifuger à 4 °C pendant 5 min à 10 000 x g pour éliminer les débris cellulaires. Gardez le surnageant.
3. em>6.3Quantification des protéines : Déterminer la concentration en protéines à l’aide d’un kit de réactifs de dosage des protéines BCA.
4. em>6.4Électrophorèse : Charger un échantillon de protéines de 50 μg et le séparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 12 % (SDS-PAGE).
5. Transfert sur membrane : Transfert électrophorétique sur des membranes PVDF à l’aide d’un système de transfert électrophorétique.
6. Subdiviser les membranes : Subdivisez les membranes et analysez chaque protéine d’intérêt, β-actine et GAPDH à partir d’un seul transfert.
7. Blocage : Bloquer les membranes pendant 1 h dans du TBST contenant 5 % de lait écrémé à température ambiante.
8. Incuber l’anticorps primaire : Incuber avec l’anticorps primaire de la caspase-9 clivée (dilution 1:200), de la caspase-3 clivée (dilution 1:200), de la caspase-7 clivée (dilution 1:200) et de la β-actine (dilution 1:1000) pendant la nuit à 4 °C. Lavez les membranes avec du TBST pendant 5 min, répétez 3 fois.
9. Incuber le deuxième anticorps : Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1:2000) pendant 2 h à température ambiante. Lavez les membranes avec du TBST pendant 5 min, répétez 3 fois.
10. Exposition : Visualisez les protéines marquées à l’aide du substrat Western blot, et enfin, exposez les membranes pour visualiser les bandes protéiques en mode d’exposition automatique.
11. Calculez la teneur en protéines⁷ en mesurant la densité de la bande protéique.

7. Analyse statistique

1. Analysez les données à l’aide du logiciel SPSS 19.0 et présentez-les sous forme de moyenne ± d’écart-type. Effectuez des analyses statistiques des valeurs observées à l’aide de l’analyse de variance à un facteur. Prenons p< 0,05 comme statistiquement significatif.

Résultats

Après la coloration HE, toutes les couches rétiniennes des rats du groupe témoin avaient une structure tissulaire claire, une disposition ordonnée des cellules et une coloration uniforme, tandis que la structure rétinienne des rats du groupe modèle a été considérablement endommagée, la couche rétinienne externe était plus mince, la couche nucléaire externe était presque complètement intégrée à la couche centrale interne, la disposition des cellules dans la couche était...

Discussion

La RP est une maladie rétinienne courante dans les cliniques. L’apparition, la gravité et la progression de la RP sont liées aux gènes et aux modes génétiques et sont affectées par l’environnement ^8,11. La RP comprend la RP familiale et la RP occasionnelle, dont la RP familiale représente environ 60 % des patients. En retraçant les antécédents génétiques familiaux, 83 gènes liés à la RP ont été identifiés j...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970