N-甲基-N-亚硝基脲诱导大鼠视网膜损伤采样及病理变化多指标评价

摘要

该方案描述了大鼠视网膜取样的程序，并利用苏木精-伊红染色、TUNEL 测定和 Western blot 来检测腹膜内注射 N-甲基-N-亚硝基脲后视网膜的病理变化和细胞凋亡。

摘要

视网膜病变可见于大多数眼部疾病和糖尿病的晚期并发症。特异性色素上皮细胞和视细胞的损伤和变性是视网膜病变的主要特征。许多传统药物在治疗视网膜病变方面显示出巨大的临床疗效。如何快速、完整地获得视网膜是治疗视网膜病变的传统医学研究中的关键步骤。在这项研究中，我们旨在为 N-甲基-N-亚硝基脲 （MNU） 诱导的大鼠视网膜损伤采样和病理变化的多指标评估提供一种标准化且可执行的程序。大鼠腹膜内注射 60 mg/kg MNU 1 次，诱导视网膜损伤，7 天后获得视网膜标本。此外，我们进行了苏木精-伊红染色以评估视网膜病理变化。通过 TUNEL 和 Western blot 测定细胞凋亡率和细胞凋亡蛋白。这些用于视网膜取样和病理变化评估的标准化方案有助于促进视网膜病变机制的探索和新型有效传统草药的发现。

引言

视网膜色素变性 （RP） 是一种遗传性和致盲性视网膜疾病¹。RP 的发病率在 1/3500 到 1/5000 之间，影响全球约 250 万人的视觉功能。它是导致人类视力障碍的最知名疾病之一，给整个社会带来了沉重的负担²。该病的特征是视网膜色素上皮细胞功能逐渐丧失和光感受器进行性凋亡。在早期，患者会出现夜盲症，表现为周边视野缺损，最终导致中央视力丧失³。因此，抑制视网膜光感受器凋亡是预防和治疗 RP 的重点。

视网膜细胞凋亡是人类 RP 和模式动物的常见特征⁴。大鼠腹腔注射 60 mg/kg N-甲基-N-亚硝基脲 （MNU） 7 天可诱导视网膜感光细胞凋亡和丢失，是 RP ^5,6 常用的动物模型。分析模型动物病理结构、特异性细胞凋亡和视网膜组织凋亡相关蛋白表达的变化，可为研究人 RP 的发病机制和筛选药物提供有效的实验数据和理论支持^7,8。因此，视网膜标本的质量决定了实验数据的可靠性。然而，由于眼组织的特殊性，关于如何获得大鼠视网膜⁹ 的报道很少。

本文为克服上述缺点，为大鼠视网膜取样提供了一种简单、快速、标准化、可作的程序。苏木精-伊红染色 （HE）、末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿嘧啶-地高辛缺口末端标记 （TUNEL） 染色和 Western blot 分析大鼠视网膜组织损伤和细胞凋亡的病理变化。所有方法均源自我们研究小组在特定作流程方面的经验。

研究方案

所有方案和外科手术均经宁夏医科大学伦理委员会批准（伦理编号：NO. 2020-Q066）。SPF Sprauge-Dawley （SD） 雄性大鼠，年龄 7-8 周龄，体重 200-220 g，购自宁夏医科大学，动物许可证号为 SCXK（宁）2020-0001。所有动物均在宁夏医科大学实验动物中心饲养。温度和湿度适宜，保持了昼夜光照循环，食物和水免费充足。

1. 术前准备

1. 材料准备
   1. 准备大鼠板、吸入麻醉装置、嵌入式盒子、冷冻储存管、一次性手术手套和口罩、广口瓶、4% 多聚甲醛、冰袋、眼科剪刀、眼科镊子、手术刀片和刀柄、1.5 mL 微量离心管并提前消毒（见 材料表）。
2. 动物准备
   1. 将 20 只雄性 SD 大鼠随机分为模型组 （n=10） 和对照组 （n=10）。用 60 mg/kg MNU 腹膜内注射模型大鼠，用相同体积的生理盐水腹膜内注射对照大鼠。
   2. 注射 7 天后，让大鼠禁食，让它们在采样前一晚自由饮水。
   3. 第二天，将大鼠仰卧在手术台上，并使用面罩使用 4% 异氟醚和 2 L/min 氧气进行麻醉。通过捏住脚的中心来测量麻醉深度，以观察大鼠的反应。

2. 用于蛋白质因子检测的视网膜采样

1. 用左手固定大鼠的眼窝，用右手用眼科弯曲镊子适度用力取出眼睛。将眼球置于冷玻璃盘中的矢状位置。
2. 左手拿着眼科直镊子固定眼球，右手拿着手术刀片，在晶状体部位附近做一个 2 毫米的纵向切口。
3. 用眼科剪刀沿切口切掉角膜，轻轻剥去晶状体、玻璃体，露出眼罩。
4. 将眼杯底部放在 1.5 mL 微量离心管的尖端，将眼杯翻转到管上，露出视网膜（视网膜呈淡黄色）。
5. 用眼科弯曲镊子沿眼球巩膜壁去除整个视网膜，然后将其放入冷冻管中并储存在液氮罐中以备将来使用（图 1）。

3. 用于病理检查和特异性细胞染色的视网膜取样

1. 用左手，用眼镊提起大鼠的眼角。用右手，用手术刀片沿着大鼠的眼角切一个 4 毫米的开口。
2. 用镊子夹住左手眼球开口处的眼球边缘。用眼用剪刀沿眼球边缘剪掉周围组织，同时注意清洁眼球周围组织。
3. 用镊子将眼球后极视神经周围的组织分开，切断视神经，注意保存。然后，取出眼球。
4. 用生理盐水清洗取出的眼球以去除任何残留的血液，将其滚动在滤纸上以吸收多余的水分，然后将其放在冷锡箔上。
5. 用眼用镊子固定眼睛。用手术刀片沿着角膜和视网膜的交界处做一个 4 毫米的纵向切口。
6. 用眼科剪刀去除角膜，沿着切口做一个圆周切割，轻轻去除晶状体和玻璃体。
7. 将剩余的带有视神经的眼罩放入包埋盒中，并将其固定在 4% 多聚甲醛中。
8. 将多聚甲醛固定的样品包埋在石蜡中，并切成 4 μm 切片用于 HE 染色和 TUNEL 染色⁷。

4. 大鼠视网膜 HE 染色

1. 脱蜡和水合：将切片放入二甲苯中 10 分钟，再重复该过程 10 分钟，然后用无水乙醇处理 5 分钟，再重复乙醇处理 5 分钟，然后在 95% 酒精中处理 5 分钟，然后在 85% 酒精中处理 5 分钟，最后在 75% 酒精中处理 5 分钟。
2. 苏木精染色：用去离子水冲洗切片 5 分钟。使用 100 μL 苏木精染色液染色 5 分钟，用去离子水冲洗 5-10 秒。加入 100 μL 1% 盐酸乙醇 30 秒，用去离子水冲洗 20 分钟，然后加入 100 μL 0.2% 氨水 1 分钟。用去离子水冲洗 5 分钟。
3. 伊红染色：使用 100 μL 伊红染色液染色 5 分钟，然后用去离子水冲洗 30 秒。
4. 脱水和密封：将切片浸入 70% 酒精中 5 分钟，然后浸入 85% 酒精中 5 分钟，然后浸入 90% 酒精中 5 分钟，然后浸入无水乙醇中 5 分钟。重复无水乙醇处理 5 分钟，然后浸入二甲苯中 5 分钟，再重复该过程 5 分钟。最后，通过在切片表面添加大约 100 μL 的中性树脂进行密封，然后用盖玻片覆盖。
5. 玻片成像：将染色的切片放在显微镜上，调整显微镜的焦距直到图像清晰可见，将放大倍率设置为 400 倍，然后捕获图像。
6. 测量视网膜总厚度和视网膜外层厚度：测量视网膜总厚度和视网膜外层厚度（外核层和感光层的厚度），并计算视网膜外层厚度百分比
   视网膜外层厚度 （%） =（视网膜外层厚度/视网膜总厚度）x 100。

5. 用 TUNEL 法测定视网膜感光细胞凋亡率

1. 脱蜡和水合：将切片放入二甲苯中 10 分钟，再重复该过程 10 分钟，然后放入无水乙醇中 5 分钟，再重复此步骤 5 分钟。将 95% 酒精放入 5 分钟、90% 酒精 5 分钟、80% 酒精 5 分钟、70% 酒精 5 分钟，然后用去离子水冲洗 5 分钟，进行脱水。
2. 用 0.85% 氯化钠溶液冲洗 5 分钟，用 PBS 冲洗 5 分钟。使用 4% 多聚甲醛用多聚甲醛固定 15 分钟。用 PBS 冲洗 5 分钟，然后重复该过程 5 分钟。
3. 孵育和平衡⁷：与 20 μg/mL 蛋白酶 K 溶液一起孵育消化 15 分钟，在平衡缓冲液中平衡 10 分钟，并与重组末端脱氧核苷酸转移酶 （rTdT） 缓冲液在 37 °C 下孵育 60 分钟。
4. 终止反应：加入 100 μL 标准柠檬酸盐溶液（2x SSC 溶液），持续 15 分钟。用 PBS 冲洗 5 分钟，然后重复该过程 5 分钟。
5. 细胞核染料：加入 100 μL 4 ′，6-二脒-2-苯吼 （DAPI） 试剂 5 分钟。用去离子水洗涤 5 分钟，然后重复该过程 5 分钟。
6. 密封：擦去切片周围多余的二甲苯，并在切片表面加入约 100 μL 的中性树脂进行密封，然后用盖玻片盖住。
7. 显微镜检查：将染色的切片放在显微镜上，调整显微镜的焦距以获得清晰的可见度，将放大倍率设置为 400 倍，然后捕获图像。使用标准荧光滤光片观察 520 ± 20 nm 处的绿色荧光。观察 460 nm 处的蓝色 DAPI。
8. 计算细胞凋亡率：测量视网膜外核层的绿色荧光值和蓝色荧光值。计算细胞凋亡率为
   细胞凋亡率 = 绿色荧光值/蓝色荧光值 x 100。

6. 蛋白质印迹分析 ¹⁰

1. 裂解缓冲液处理：用 50 μL 冷裂解缓冲液（1 mL 裂解缓冲液，含有 5 μL 磷酸酶抑制剂、1 μL 蛋白酶抑制剂和 5 μL 100 mM PMSF）切碎并匀浆一个冷冻视网膜。
2. 在冰浴上进行 28 kHz 超声处理 5 秒;重复 3 次。在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。保留上清液。
3. em>6.3蛋白质定量：使用 BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。
4. em>6.4电泳：上样 50 μg 蛋白质样品，并在 12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 上分离。
5. 转印到膜上：使用电泳转印系统电泳转印到 PVDF 膜上。
6. 细分膜：细分膜，并通过单次转移分析每种目标蛋白、β-肌动蛋白和 GAPDH。
7. 封闭：在室温下在含有 5% 脱脂牛奶的 TBST 中封闭膜 1 小时。
8. 一抗孵育：与裂解的 caspase-9（1：200 稀释）、裂解的 caspase-3（1：200 稀释）、裂解的 caspase-7（1：200 稀释）和 β-肌动蛋白（1：1000 稀释）的一抗在 4 °C 下孵育过夜。 用 TBST 洗涤膜 5 分钟，重复 3 次。
9. 孵育二抗：与辣根过氧化物酶偶联的二抗 （1：2000） 在室温下孵育 2 小时。用 TBST 洗涤膜 5 分钟，重复 3 次。
10. 曝光：使用 Western 印迹底物可视化标记的蛋白质，最后，曝光膜以在自动曝光模式下可视化蛋白质条带。
11. 通过测量蛋白质条带密度来计算蛋白质含量⁷ 。

7. 统计分析

1. 使用 SPSS 19.0 软件分析数据，并将其显示为平均值±标准差。使用单因子方差分析对观测值执行统计分析。以 p< 0.05 为统计显著性。

结果

HE染色后，对照组大鼠所有视网膜层组织结构清晰，细胞排列有序，染色均匀，而模型组大鼠视网膜结构明显受损，视网膜外层较薄，外核层几乎与内核层完全融合，层内细胞排列极为紊乱， 细胞层数显著减少，感光细胞层和外核层厚度显著变薄。对照组和模型组视网膜外层的厚度分别为 48% 和 23% （p < 0.01; 图 2）。

TUNEL 方法显...

讨论

RP 是临床上常见的视网膜疾病。RP 的发作、严重程度和进展与基因和遗传模式有关，并受环境影响 ^8,11。RP 包括家族性 RP 和偶发性 RP，其中家族性 RP 约占患者的 60%。通过追溯家族遗传史，目前已鉴定出 83 个与 RP 相关的基因，偶发 RP 约占 40%，这意味着这类患者缺乏家族史，遗传模式不规则²。尽管视网膜感光...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970