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Method Article
该方案描述了大鼠视网膜取样的程序,并利用苏木精-伊红染色、TUNEL 测定和 Western blot 来检测腹膜内注射 N-甲基-N-亚硝基脲后视网膜的病理变化和细胞凋亡。
视网膜病变可见于大多数眼部疾病和糖尿病的晚期并发症。特异性色素上皮细胞和视细胞的损伤和变性是视网膜病变的主要特征。许多传统药物在治疗视网膜病变方面显示出巨大的临床疗效。如何快速、完整地获得视网膜是治疗视网膜病变的传统医学研究中的关键步骤。在这项研究中,我们旨在为 N-甲基-N-亚硝基脲 (MNU) 诱导的大鼠视网膜损伤采样和病理变化的多指标评估提供一种标准化且可执行的程序。大鼠腹膜内注射 60 mg/kg MNU 1 次,诱导视网膜损伤,7 天后获得视网膜标本。此外,我们进行了苏木精-伊红染色以评估视网膜病理变化。通过 TUNEL 和 Western blot 测定细胞凋亡率和细胞凋亡蛋白。这些用于视网膜取样和病理变化评估的标准化方案有助于促进视网膜病变机制的探索和新型有效传统草药的发现。
视网膜色素变性 (RP) 是一种遗传性和致盲性视网膜疾病1。RP 的发病率在 1/3500 到 1/5000 之间,影响全球约 250 万人的视觉功能。它是导致人类视力障碍的最知名疾病之一,给整个社会带来了沉重的负担2。该病的特征是视网膜色素上皮细胞功能逐渐丧失和光感受器进行性凋亡。在早期,患者会出现夜盲症,表现为周边视野缺损,最终导致中央视力丧失3。因此,抑制视网膜光感受器凋亡是预防和治疗 RP 的重点。
视网膜细胞凋亡是人类 RP 和模式动物的常见特征4。大鼠腹腔注射 60 mg/kg N-甲基-N-亚硝基脲 (MNU) 7 天可诱导视网膜感光细胞凋亡和丢失,是 RP 5,6 常用的动物模型。分析模型动物病理结构、特异性细胞凋亡和视网膜组织凋亡相关蛋白表达的变化,可为研究人 RP 的发病机制和筛选药物提供有效的实验数据和理论支持7,8。因此,视网膜标本的质量决定了实验数据的可靠性。然而,由于眼组织的特殊性,关于如何获得大鼠视网膜9 的报道很少。
本文为克服上述缺点,为大鼠视网膜取样提供了一种简单、快速、标准化、可作的程序。苏木精-伊红染色 (HE)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿嘧啶-地高辛缺口末端标记 (TUNEL) 染色和 Western blot 分析大鼠视网膜组织损伤和细胞凋亡的病理变化。所有方法均源自我们研究小组在特定作流程方面的经验。
所有方案和外科手术均经宁夏医科大学伦理委员会批准(伦理编号:NO. 2020-Q066)。SPF Sprauge-Dawley (SD) 雄性大鼠,年龄 7-8 周龄,体重 200-220 g,购自宁夏医科大学,动物许可证号为 SCXK(宁)2020-0001。所有动物均在宁夏医科大学实验动物中心饲养。温度和湿度适宜,保持了昼夜光照循环,食物和水免费充足。
1. 术前准备
2. 用于蛋白质因子检测的视网膜采样
3. 用于病理检查和特异性细胞染色的视网膜取样
4. 大鼠视网膜 HE 染色
5. 用 TUNEL 法测定视网膜感光细胞凋亡率
6. 蛋白质印迹分析 10
7. 统计分析
HE染色后,对照组大鼠所有视网膜层组织结构清晰,细胞排列有序,染色均匀,而模型组大鼠视网膜结构明显受损,视网膜外层较薄,外核层几乎与内核层完全融合,层内细胞排列极为紊乱, 细胞层数显著减少,感光细胞层和外核层厚度显著变薄。对照组和模型组视网膜外层的厚度分别为 48% 和 23% (p < 0.01; 图 2)。
TUNEL 方法显...
RP 是临床上常见的视网膜疾病。RP 的发作、严重程度和进展与基因和遗传模式有关,并受环境影响 8,11。RP 包括家族性 RP 和偶发性 RP,其中家族性 RP 约占患者的 60%。通过追溯家族遗传史,目前已鉴定出 83 个与 RP 相关的基因,偶发 RP 约占 40%,这意味着这类患者缺乏家族史,遗传模式不规则2。尽管视网膜感光...
作者没有什么可披露的。
这项工作得到了宁夏高等教育厅 (NYG2022029) 科研项目的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Imager | GE | 680 | |
Ammonium persulfate | Boster Biological Technology Co.,Ltd | A8090 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | ME104E | |
BCA protein quantization kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP902 | |
cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | #9664 | |
cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | #8438 | |
cleaved caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | #9507 | |
DeadEnd Fluorometric TUNEL System | Promega | G3250 | |
Glycine | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1200 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Bioss Antibodies | bs-80295G-HRP | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
High speed crusher | Thermo Fisher Scientific | AG22331 | |
Immobilon-P SQ Transfer membranes | Merck Millipore. Ltd | ISEQ00010 | |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22-10 | |
Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific | 1510 | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
Mini-PROTEAN Tetra | BIO-RAD | 1658001 | |
N-Methyl-N-Nitrosourea | sigma-Aldrich | N4766–100G | |
Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
Page Pre-solution (30% ) | Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd | L3202A | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26617 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×) | Beyotime Biotechnology | P0015 | |
Skim milk powder | BioFroxx | 1172GR500 | |
Sprague Dawley rats | Ningxia Medical University | SCXK (Ning) 2020-0001 | |
TEMED | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1165 | |
Total protein extraction kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP2100 | |
Trans-Blot Module | BIO-RAD | 1703935 | |
Tris base | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1162 | |
Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 |
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