Campionamento del danno alla retina di ratto indotto da N-metil-N-nitrosourea e valutazione multi-indice dei cambiamenti patologici

Riepilogo

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento della retina nel ratto e l'utilizzo della colorazione ematossilina-eosina, del saggio TUNEL e del Western blot per rilevare cambiamenti patologici e apoptosi nella retina dopo l'iniezione intraperitoneale di N-metil-N-nitrosourea.

Abstract

La retinopatia può essere osservata nella maggior parte delle malattie oculari e nelle complicanze tardive del diabete mellito. Il danno e la degenerazione delle cellule epiteliali pigmentate specifiche e delle cellule ottiche sono le caratteristiche principali della retinopatia. Molte medicine tradizionali hanno dimostrato una notevole efficacia clinica nel trattamento della retinopatia. Come ottenere una retina in modo rapido e completo è un passo fondamentale nella ricerca della medicina tradizionale per il trattamento della retinopatia. In questo studio, miriamo a fornire una procedura standardizzata ed esercitabile per il campionamento del danno alla retina di ratto indotto da N-metil-N-nitrosourea (MNU) e la valutazione multi-indice dei cambiamenti patologici. Ai ratti è stato iniettato per via intraperitoneale 60 mg/kg di MNU una volta per indurre danni alla retina e i campioni di retina sono stati ottenuti dopo 7 giorni. Inoltre, abbiamo eseguito la colorazione ematossilina-eosina per valutare i cambiamenti patologici della retina. Determinazione del tasso di apoptosi e della proteina di apoptosi mediante TUNEL e Western blot. Questi protocolli standardizzati per il campionamento retinico e la valutazione delle alterazioni patologiche sono utili per promuovere l'esplorazione del meccanismo della retinopatia e la scoperta di nuove ed efficaci erbe tradizionali.

Introduzione

La retinite pigmentosa (RP) è una malattia ereditaria e accecante^{della retina 1}. L'incidenza della RP è compresa tra 1/3500 e 1/5000, influenzando la funzione visiva di circa 2,5 milioni di persone nel mondo. È una delle malattie più note che porta alla disabilità visiva negli esseri umani, imponendo un onere significativo all'intera società². La malattia è caratterizzata dalla graduale perdita della funzione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche e dalla progressiva apoptosi dei fotorecettori. Nella fase iniziale, i pazienti sperimentano la cecità notturna, che si manifesta con difetti del campo visivo periferico e alla fine porta alla perdita della visione centrale³. Pertanto, l'inibizione dell'apoptosi dei fotorecettori retinici è il punto di riferimento per la prevenzione e il trattamento della RP.

L'apoptosi delle cellule retiniche è una caratteristica comune della RP umana e degli animali modello⁴. L'iniezione intraperitoneale di 60 mg/kg di N-metil-N-nitrosourea (MNU) nei ratti per 7 giorni può indurre apoptosi e perdita di cellule fotorecettrici retiniche ed è un modello animale comunemente usato di RP ^5,6. L'analisi dei cambiamenti nella struttura patologica, nell'apoptosi cellulare specifica e nell'espressione proteica correlata all'apoptosi del tessuto retinico negli animali modello può fornire dati sperimentali efficaci e supporto teorico nello studio della patogenesi della RP umana e dei farmaci di screening ^7,8. Pertanto, la qualità dei campioni retinici determina l'affidabilità dei dati sperimentali. Tuttavia, a causa della particolarità del tessuto oculare, ci sono pochissimi rapporti su come ottenere la retina di ratto⁹.

Questo documento fornisce una procedura semplice, veloce, standardizzata e operabile per il campionamento della retina nei ratti per superare le carenze di cui sopra. La colorazione ematossilina-eosina (HE), la colorazione terminale con deossiuridina trifosfato-digossigenina (TUNEL) mediata dalla deossiuridina transferasi terminale e il Western blot sono utilizzati per analizzare i cambiamenti patologici nel danno tissutale retinico e nell'apoptosi nei ratti. Tutti i metodi derivano dall'esperienza del nostro gruppo di ricerca con i processi operativi specifici.

Protocollo

Tutti i protocolli e le procedure chirurgiche sono stati approvati dal Comitato Etico della Ningxia Medical University (Numero Etico: N. 2020-Q066). I ratti maschi SPF Sprauge-Dawley (SD), di età compresa tra 7 e 8 settimane e del peso di 200-220 g, sono stati acquistati dalla Ningxia Medical University con il numero di licenza animale SCXK (Ning) 2020-0001. Tutti gli animali sono stati allevati nel Laboratory Animal Center della Ningxia Medical University. La temperatura e l'umidità erano adatte, il ciclo di luce giorno-notte era mantenuto e il cibo e l'acqua erano gratuiti e sufficienti.

1. Preparazione preoperatoria

1. Preparazione dei materiali
   1. Preparare piastre per ratti, dispositivi per anestesia per inalazione, scatole incorporate, provette per la conservazione congelata, guanti e maschere chirurgiche monouso, flaconi a bocca larga, paraformaldeide al 4%, impacchi di ghiaccio, forbici oftalmiche, pinzette oftalmiche, lame chirurgiche e manici di coltelli, provette per microcentrifuga da 1,5 ml e sterilizzarle in anticipo (vedere la Tabella dei materiali).
2. Preparazione degli animali
   1. Dividi casualmente 20 ratti SD maschi in gruppo modello (n=10) e gruppo di controllo (n=10). Iniettare i ratti modello per via intraperitoneale con 60 mg/kg di MNU e iniettare i ratti di controllo per via intraperitoneale con lo stesso volume di soluzione fisiologica.
   2. Dopo 7 giorni di iniezione, digiunare i ratti e lasciarli bere liberamente la sera prima del prelievo.
   3. Il giorno successivo, posizionare il ratto supino sul tavolo operatorio e utilizzare una maschera per somministrare l'anestesia utilizzando isoflurano al 4% e 2 L/min di ossigeno. Misura la profondità dell'anestesia pizzicando il centro del piede per osservare le reazioni dei ratti.

2. Campionamento retinico per la rilevazione del fattore proteico

1. Fissare l'orbita oculare del ratto con la mano sinistra e rimuovere l'occhio con forza moderata con la mano destra utilizzando una pinza oftalmica di flessione. Posizionare il bulbo oculare in posizione sagittale in un piatto di vetro freddo.
2. Con la mano sinistra che tiene una pinzetta dritta oftalmica per fissare il bulbo oculare e la mano destra che tiene la lama chirurgica, praticare un'incisione longitudinale di 2 mm vicino al sito della lente.
3. Tagliare la cornea con le forbici oftalmiche lungo l'incisione e staccare delicatamente la lente, il vitreo ed esporre la conchiglia oculare.
4. Posizionare la parte inferiore dell'oculare sulla punta della provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, capovolgere l'oculare sulla provetta ed esporre la retina (la retina è di un giallo tenue).
5. Rimuovere l'intera retina lungo la parete sclerale del bulbo oculare con una pinzetta di flessione oftalmica, quindi posizionarla in una provetta congelata e conservarla in un serbatoio di azoto liquido per un uso futuro (Figura 1).

3. Prelievo di retina per esame patologico e colorazione cellulare specifica

1. Con la mano sinistra, usa le pinzette per sollevare l'angolo dell'occhio del topo. Con la mano destra, utilizzare una lama chirurgica per tagliare un'apertura di 4 mm lungo l'angolo dell'occhio del topo.
2. Usa le pinzette per fissare il bordo del bulbo oculare all'apertura della mano sinistra. Usa le forbici oftalmiche per tagliare i tessuti circostanti lungo il bordo del bulbo oculare prestando attenzione alla pulizia dei tessuti circostanti del bulbo oculare.
3. Separare i tessuti attorno al nervo ottico al polo posteriore del bulbo oculare con una pinzetta, tagliare il nervo ottico e prestare attenzione a preservarlo. Quindi, rimuovi il bulbo oculare.
4. Lavare il bulbo oculare rimosso in soluzione salina per rimuovere il sangue rimasto, arrotolarlo su carta da filtro per assorbire l'acqua in eccesso e posizionarlo su carta stagnola fredda.
5. Fissa l'occhio con una pinzetta oftalmica. Praticare un'incisione longitudinale di 4 mm lungo la giunzione della cornea e della retina con una lama chirurgica.
6. Rimuovere la cornea con le forbici oftalmiche, fare un taglio circolare lungo l'incisione e rimuovere delicatamente il cristallino e il corpo vitreo.
7. Posizionare la conchiglia oculare rimanente con un nervo ottico in una scatola da inclusione e fissarla in paraformaldeide al 4%.
8. Incorporare campioni fissati con paraformaldeide in paraffina e tagliarli in fette da 4 μm per la colorazione HE e la colorazione TUNEL⁷.

4. Colorazione HE della retina di ratto

1. Deceratura e idratazione: Mettere le fette nello xilene per 10 minuti, ripetere il processo per altri 10 minuti, seguito da etanolo assoluto per 5 minuti, ripetere il trattamento con etanolo per altri 5 minuti, seguito da un trattamento in alcol al 95% per 5 minuti, quindi in alcol all'85% per 5 minuti e infine in alcol al 75% per 5 minuti.
2. Colorazione con ematossilina: Sciacquare la fetta con acqua deionizzata per 5 minuti. Utilizzare 100 μL di soluzione colorante di ematossilina e colorare per 5 minuti, risciacquare con acqua deionizzata per 5-10 s. Aggiungere 100 μl di acido cloridrico etanolo all'1% per 30 s, sciacquare con acqua deionizzata per 20 minuti e aggiungere 100 μl di acqua ammoniacale allo 0,2% per 1 minuto. Risciacquare con acqua deionizzata per 5 min.
3. Colorazione con eosina: utilizzare 100 μL di soluzione colorante con eosina per colorare per 5 minuti e risciacquare con acqua deionizzata per 30 s.
4. Disidratazione e sigillatura: immergere le fette in alcol al 70% per 5 minuti, poi all'85% di alcol per 5 minuti, seguito da alcol al 90% per 5 minuti ed etanolo assoluto per 5 minuti. Ripetere il trattamento con etanolo assoluto per altri 5 minuti, quindi immergere nello xilene per 5 minuti e ripetere il processo per altri 5 minuti. Infine, sigillare aggiungendo circa 100 μL di resina neutra sulla superficie delle fette e poi coprirla con un vetro di copertura.
5. Imaging dei vetrini: posizionare le fette colorate sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando l'immagine non è chiaramente visibile, impostare l'ingrandimento a 400x e acquisire l'immagine.
6. Misurare lo spessore retinico totale e lo spessore retinico esterno: misurare lo spessore retinico totale e lo spessore retinico esterno (spessore dello strato nucleare esterno e dello strato dei fotorecettori) e calcolare la percentuale di spessore retinico esterno
   Spessore retinico esterno (%) = (spessore retinico esterno/spessore retinico totale) x 100.

5. Determinazione del tasso di apoptosi delle cellule fotorecettrici retiniche con metodo TUNEL

1. Deceratura e idratazione: Mettere le fette nello xilene per 10 minuti, ripetere il processo per altri 10 minuti, quindi immergerle in etanolo assoluto per 5 minuti e ripetere questo passaggio per altri 5 minuti. Eseguire la disidratazione immergendo alcol al 95% per 5 minuti, alcol al 90% per 5 minuti, alcol all'80% per 5 minuti, alcol al 70% per 5 minuti e risciacquare con acqua deionizzata per 5 minuti.
2. Risciacquare con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% per 5 minuti e PBS per 5 minuti. Fissare con paraformaldeide utilizzando paraformaldeide al 4% per 15 min. Risciacquare con PBS per 5 minuti e ripetere il processo per altri 5 minuti.
3. Incubazione ed equilibrio⁷: Incubare con 20 μg/mL di soluzione di proteinasi K per la digestione per 15 minuti, equilibrare nel tampone di equilibrio per 10 minuti e incubare con tampone deossinucleotidiltransferasi terminale ricombinante (rTdT) a 37 °C per 60 minuti.
4. Reazione di arresto: aggiungere 100 μl della soluzione standard di citrato (2x soluzione SSC) per 15 min. Risciacquare con PBS per 5 minuti e ripetere il processo per altri 5 minuti.
5. Colorante nucleare: aggiungere 100 μl di reagente 4 ′, 6-diamidina-2-fenindl (DAPI) per 5 minuti. Lavare con acqua deionizzata per 5 minuti e ripetere il processo per altri 5 minuti.
6. Sigillare: Pulire lo xilene in eccesso intorno alle fette e sigillare aggiungendo circa 100 μL di resina neutra sulla superficie delle fette, quindi coprirla con un vetro di copertura.
7. Microscopia: posizionare le fette colorate sul microscopio, regolare la messa a fuoco del microscopio per una chiara visibilità, impostare l'ingrandimento su 400x e acquisire l'immagine. Osservare la fluorescenza verde a 520 ± 20 nm utilizzando un filtro a fluorescenza standard. Osservare il blu DAPI a 460 nm.
8. Calcola il tasso di apoptosi: misura i valori di fluorescenza verde e i valori di fluorescenza blu dello strato esterno del nucleo retinico. Calcola il tasso di apoptosi come
   Velocità di cella di apoptosi = valore di fluorescenza verde/valore di fluorescenza blu x 100.

6. Analisi Western blot ¹⁰

1. Trattamento tampone di lisi: Tritare e omogeneizzare una retina congelata con 50 μL di tampone di lisi fredda (1 mL di tampone di lisi contenente 5 μL di inibitore della fosfatasi, 1 μL di inibitore della proteasi e 5 μL di PMSF da 100 mM).
2. Soggetto a una sonicazione a 28 kHz per 5 s su un bagno di ghiaccio; Ripeti 3 volte. Centrifugare a 4 °C per 5 minuti a 10.000 x g per rimuovere i detriti cellulari. Conserva il surnatante.
3. em>6.3Quantificazione delle proteine: Determinare la concentrazione proteica utilizzando un kit di reagenti per il dosaggio delle proteine BCA.
4. em>6.4Elettroforesi: caricare un campione di proteina da 50 μg e separare su elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio al 12% (SDS-PAGE).
5. Trasferimento su membrana: Trasferimento elettroforetico su membrane in PVDF utilizzando un sistema di trasferimento elettroforetico.
6. Suddividere le membrane: suddividere le membrane e analizzare ogni proteina di interesse, β-actina e GAPDH da un singolo trasferimento.
7. Bloccaggio: Bloccare le membrane per 1 ora in TBST contenente il 5% di latte scremato a temperatura ambiente.
8. Incubare l'anticorpo primario: incubare con l'anticorpo primario della caspasi-9 scissa (diluizione 1:200), della caspasi-3 scissa (diluizione 1:200), della caspasi-7 scissa (diluizione 1:200) e della β-actina (diluizione 1:1000) per una notte a 4 °C. Lavare le membrane con TBST per 5 minuti, ripetere 3 volte.
9. Incubare il secondo anticorpo: Incubare con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (1:2000) per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le membrane con TBST per 5 minuti, ripetere 3 volte.
10. Esposizione: visualizzare le proteine marcate utilizzando il substrato Western blot e, infine, esporre le membrane per visualizzare le bande proteiche in una modalità di esposizione automatica.
11. Calcola il contenuto proteico⁷ misurando la densità della banda proteica.

7. Analisi statistica

1. Analizza i dati utilizzando il software SPSS 19.0 e presentali come media ± deviazione standard. Eseguire analisi statistiche dei valori osservati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza. Prendi p< 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Dopo la colorazione HE, tutti gli strati retinici dei ratti nel gruppo di controllo avevano una struttura tissutale chiara, una disposizione ordinata delle cellule e una colorazione uniforme, mentre la struttura retinica dei ratti nel gruppo modello era significativamente danneggiata, lo strato retinico esterno era più sottile, lo strato nucleare esterno era quasi completamente integrato con lo strato centrale interno, la disposizione delle cellule nello strato era estremamente disordin...

Discussione

La RP è una malattia retinica comune nelle cliniche. L'insorgenza, la gravità e la progressione della RP sono correlate ai geni e alle modalità genetiche e sono influenzate dall'ambiente ^8,11. La RP comprende la RP familiare e la RP occasionale, di cui la RP familiare rappresenta circa il 60% dei pazienti. Attraverso il tracciamento della storia genetica familiare, finora sono stati identificati 83 geni correlati alla RP, ment...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970