N-methyl-N-nitrosourea-induced Rat's Retina Damage 샘플링 및 병리학적 변화의 다중 지수 평가

요약

이 프로토콜은 쥐 망막 샘플링 및 헤마톡실린-에오신 염색, TUNEL 분석 및 웨스턴 블롯을 활용하여 N-Methyl-N-Nitrosourea의 복강내 주사 후 망막의 병리학적 변화 및 세포사멸을 감지하는 절차를 설명합니다.

초록

망막병증은 대부분의 안과 질환과 진성 당뇨병의 후기 합병증에서 관찰될 수 있습니다. 특정 색소, 상피 세포, 시신경 세포의 손상 및 퇴화가 망막병증의 주요 특징입니다. 많은 전통 의학이 망막병증 치료에 상당한 임상적 효능을 보여주었습니다. 망막을 빠르고 완벽하게 얻는 방법은 망막병증 치료를 위한 전통 의학 연구의 핵심 단계입니다. 이 연구에서는 N-methyl-N-nitrosourea (MNU)에 의한 쥐의 망막 손상 샘플링 및 병리학적 변화에 대한 다중 지표 평가를 위한 표준화되고 실행 가능한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막 손상을 유도하기 위해 쥐에게 60mg/kg MNU를 한 번 복강내 주사하고 7일 후에 망막 샘플을 얻었습니다. 또한, 망막 병리학적 변화를 평가하기 위해 헤마톡실린-에오신 염색을 실시했다. TUNEL과 웨스턴 블롯에 의한 세포사멸 속도 및 세포사멸 단백질의 측정. 망막 샘플링 및 병리학적 변화 평가를 위한 이러한 표준화된 프로토콜은 망막병증의 메커니즘을 탐구하고 새롭고 효과적인 전통 허브의 발견을 촉진하는 데 도움이 됩니다.

서문

색소성 망막염(RP)은 유전성 및 실명 망막 질환입니다¹. RP의 발병률은 1/3500에서 1/5000 사이이며 전 세계 약 250만 명의 시각 기능에 영향을 미칩니다. 인간에게 시력장애를 유발하는 가장 잘 알려진 질병 중 하나로, 사회 전체에 큰 부담을 주고 있다². 이 질병은 망막 색소, 상피 세포 기능의 점진적인 상실과 광수용체의 점진적인 세포사멸이 특징입니다. 초기 단계에서 환자는 야맹증을 경험하는데, 이는 말초 시야 결함으로 나타나고 결국 중심 시력의 상실로 이어집니다³. 따라서 망막 광수용체 세포사멸(retinal photoreceptor apoptosis)의 억제는 RP의 예방과 치료를 위한 포인트컷입니다.

망막 세포 사멸은 인간 RP 및 모델 동물의 일반적인 특징입니다⁴. 쥐에게 60mg/kg N-Methyl-N-Nitrosourea(MNU)를 7일 동안 복강내 주사하면 세포사멸 및 망막 광수용체 세포의 소실을 유도할 수 있으며 일반적으로 사용되는 RP ^5,6의 동물 모델입니다. 모델 동물에서 망막 조직의 병리학적 구조, 특정 세포 자멸사 및 세포사멸 관련 단백질 발현의 변화를 분석하면 인간 RP의 발병 기전을 연구하고 약물을 스크리닝하는 데 효과적인 실험 데이터와 이론적 지원을 제공할 수 있습니다 ^7,8. 따라서 망막 표본의 품질은 실험 데이터의 신뢰성을 결정합니다. 그러나 안구 조직의 특수성으로 인해 쥐의 망막⁹를 얻는 방법에 대한 보고는 거의 없다.

이 논문은 위의 단점을 극복하기 위해 쥐의 망막 샘플링을 위한 간단하고 빠르며 표준화되고 작동 가능한 절차를 제공합니다. Hematoxylin-eosin staining(HE), 말단 deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-digoxigenin nick-end labeling(TUNEL) 염색 및 웨스턴 블롯을 사용하여 쥐의 망막 조직 손상 및 세포사멸의 병리학적 변화를 분석합니다. 모든 방법은 특정 운영 프로세스에 대한 우리 연구 그룹의 경험에서 파생되었습니다.

프로토콜

모든 프로토콜과 수술 절차는 닝샤 의과대학 윤리위원회(윤리 번호: NO. 2020-Q066)의 승인을 받았습니다. 생후 7-8주, 체중 200-220g의 SPF Sprauge-Dawley(SD) 수컷 쥐는 동물 면허 번호 SCXK(Ning) 2020-0001로 Ningxia Medical University에서 구입했습니다. 모든 동물은 닝샤 의과 대학의 실험실 동물 센터에서 사육되었습니다. 온도와 습도가 적당했고, 낮과 밤의 조명 주기가 유지되었으며, 음식과 물은 무료이며 충분했습니다.

1. 수술 전 준비

1. 재료 준비
   1. 쥐 플레이트, 흡입 마취 장치, 내장 상자, 냉동 보관 튜브, 일회용 수술용 장갑 및 마스크, 입이 넓은 병, 4% 파라포름알데히드, 얼음 팩, 안과 가위, 안과용 핀셋, 수술용 블레이드 및 칼 손잡이, 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 미리 살균합니다( 재료 표 참조).
2. 동물 준비
   1. 20마리의 수컷 SD 쥐를 무작위로 모델 그룹(n=10)과 대조군(n=10)으로 나눕니다. 모델 랫드에게 60mg/kg MNU를 복강내로 주입하고 대조군 랫드에게 동일한 양의 식염수를 복강내로 주입합니다.
   2. 주입 7일 후, 쥐를 단식시키고 샘플링 전날 밤에 자유롭게 마실 수 있도록 합니다.
   3. 다음날, 쥐를 누운 자세로 수술대에 눕히고 마스크를 사용하여 4% 이소플루란과 2L/min의 산소를 사용하여 마취를 실시합니다. 쥐의 반응을 관찰하기 위해 발 중앙을 꼬집어 마취 깊이를 측정합니다.

2. 단백질 인자 검출을 위한 망막 샘플링

1. 왼손으로 쥐의 안와를 고정하고 안과용 굽힘 겸자를 사용하여 오른손으로 적당한 힘으로 눈을 제거합니다. 차가운 유리 접시에 안구를 시상 위치에 놓습니다.
2. 왼손은 안구를 고정하기 위한 안과 핀셋을, 오른손은 수술용 칼날을 잡고 수정체 부위 부근을 2mm 세로 절개합니다.
3. 절개 부위를 따라 안과 가위로 각막을 잘라내고 수정체, 유리체를 부드럽게 벗겨내고 눈컵을 드러냅니다.
4. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브의 끝에 아이컵의 바닥을 놓고 아이컵을 튜브 위로 뒤집어 망막을 노출시킵니다(망막은 희미한 노란색임).
5. 안구 벤딩 핀셋으로 안구의 공막 벽을 따라 망막 전체를 제거한 다음 냉동 튜브에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소 탱크에 보관합니다(그림 1).

3. 병리학적인 검사 및 특정한 세포 염색을 위한 망막 표본 추출

1. 왼손으로 눈 핀셋을 사용하여 쥐의 눈꼬리를 들어 올립니다. 오른손으로 수술용 칼날을 사용하여 쥐의 눈 모서리를 따라 4mm 구멍을 자릅니다.
2. 아이 핀셋을 사용하여 왼손의 구멍에서 안구의 가장자리를 고정합니다. 안과 가위를 사용하여 안구 가장자리를 따라 주변 조직을 자르고 안구 주변 조직을 청소하는 데 주의를 기울입니다.
3. 안구의 후극에 있는 시신경 주위의 조직을 안구로 분리하고 시신경을 절개한 후 보존에 주의합니다. 그런 다음 안구를 제거합니다.
4. 제거한 안구를 식염수로 씻어 남아 있는 혈액을 제거하고 여과지에 굴려 여분의 수분을 흡수한 후 차가운 은박지에 놓습니다.
5. 안과 핀셋으로 눈을 고정합니다. 수술용 칼날로 각막과 망막의 접합부를 따라 4mm 세로 절개를 만듭니다.
6. 안과 가위로 각막을 제거하고 절개 부위를 따라 원을 그리며 절개한 후 수정체와 유리체를 부드럽게 제거합니다.
7. 시신경이 있는 나머지 아이컵을 임베딩 박스에 넣고 파라포름알데히드 4%로 고정합니다.
8. 파라포름알데히드 고정 샘플을 파라핀에 삽입하고 HE 염색 및 TUNEL 염색을 위해 4μm 조각으로 자릅니다⁷.

4. 쥐 망막의 HE 염색

1. 탈왁스 및 수화 : 슬라이스를 자일렌에 10 분 동안 놓고 10 분 동안 과정을 반복 한 다음 5 분 동안 무수 에탄올을 반복하고 5 분 동안 에탄올 처리를 반복 한 다음 95 % 알코올에서 5 분 동안 처리 한 다음 85 % 알코올에서 5 분 동안, 마지막으로 75 % 알코올에서 5 분 동안 처리합니다.
2. 헤마톡실린 염색: 슬라이스를 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다. 100μL의 헤마톡실린 염색 용액을 사용하여 5분 동안 염색하고 탈이온수로 5-10초 동안 헹굽니다. 1% 염산 에탄올 100μL를 30초 동안 넣고 탈이온수로 20분 동안 헹구고 0.2% 암모니아수 100μL를 1분 동안 추가합니다. 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.
3. 에오신 염색: 100μL의 에오신 염색 용액을 사용하여 5분 동안 염색하고 탈이온수로 30초 동안 헹굽니다.
4. 탈수 및 밀봉: 슬라이스를 70% 알코올에 5분 동안 담근 다음 85% 알코올에 5분 동안 담근 다음 90% 알코올에 5분 동안 담그고 절대 에탄올을 5분 동안 담그십시오. 무수 에탄올 처리를 5분 더 반복한 다음 크실렌에 5분 동안 담그고 5분 더 이 과정을 반복합니다. 마지막으로, 슬라이스 표면에 약 100μL의 중성 수지를 첨가하여 밀봉한 다음 커버 유리로 덮습니다.
5. 슬라이드 이미징: 현미경에 염색된 조각을 배치하고, 이미지가 명확하게 보일 때까지 현미경의 초점을 조정하고, 배율을 400배로 설정하고, 이미지를 캡처합니다.
6. 총 망막 두께 및 외부 망막 두께 측정: 총 망막 두께와 외부 망막 두께(외부 핵층과 광수용체층의 두께)를 측정하고 외부 망막 두께 백분율을 계산합니다.
   망막 바깥쪽 두께(%) = (망막 바깥쪽 두께/총 망막 두께) x 100.

5. TUNEL 방법을 이용한 망막 광수용체 세포의 세포사멸 속도 측정

1. 디왁스 및 수화: 슬라이스를 자일렌에 10분 동안 넣고 이 과정을 10분 더 반복한 다음 절대 에탄올에 5분 동안 넣고 이 단계를 5분 더 반복합니다. 95% 알코올을 5분 동안, 90% 알코올을 5분 동안, 80% 알코올을 5분 동안 넣고, 70% 알코올을 5분 동안 넣고 탈이온수로 5분 동안 헹구어 탈수를 수행합니다.
2. 0.85% 염화나트륨 용액으로 5분 동안 헹구고 PBS로 5분 동안 헹굽니다. 4% 파라포름알데히드를 사용하여 15분 동안 파라포름알데히드로 수정합니다. PBS로 5분 동안 헹구고 5분 더 이 과정을 반복합니다.
3. 배양 및 평형⁷: 분해를 위해 20μg/mL proteinase K 용액으로 15분 동안 배양하고, 평형 완충액에서 10분 동안 평형을 이루고, 37°C에서 60분 동안 재조합 말단 deoxynucleotidyltransferase(rTdT) 완충액으로 배양합니다.
4. 반응 중지: 표준 구연산염 용액 100μL(2x SSC 용액)를 15분 동안 첨가합니다. PBS로 5분 동안 헹구고 5분 더 이 과정을 반복합니다.
5. 핵 염료: 100μL 4', 6-diamidine-2-phenindl (DAPI) 시약을 5분 동안 첨가합니다. 탈이온수로 5분 동안 씻고 5분 더 이 과정을 반복합니다.
6. 밀봉: 슬라이스 주위의 과도한 자일렌을 닦아내고 슬라이스 표면에 약 100μL의 중성 수지를 첨가하여 밀봉한 다음 커버 유리로 덮습니다.
7. 현미경 검사: 염색된 조각을 현미경에 놓고 선명한 가시성을 위해 현미경의 초점을 조정하고 배율을 400배로 설정하고 이미지를 캡처합니다. 표준 형광 필터를 사용하여 520 ± 20nm에서 녹색 형광을 관찰합니다. 460nm에서 파란색 DAPI를 관찰합니다.
8. 세포사멸 속도 계산: 외부 망막 핵층의 녹색 형광 값과 청색 형광 값을 측정합니다. 세포사멸 속도를 다음과 같이 계산합니다.
   세포사멸 세포 속도 = 녹색 형광 값/청색 형광 값 x 100.

6. 웨스턴 블롯 분석 ¹⁰

1. 용해 완충액 처리: 50 μL의 저온 용해 완충액(5 μL의 인산가수분해효소 억제제, 1 μL의 프로테아제 억제제 및 5 μL의 100 mM PMSF를 포함하는 1 mL의 용해 완충액)으로 하나의 동결 망막을 다지고 균질화합니다.
2. 얼음 목욕에서 5 초 동안 28kHz 초음파 처리에 따릅니다. 3번 반복합니다. 세포 파편을 제거하기 위해 4°C에서 10,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 유지하십시오.
3. em>6.3단백질 정량화: BCA 단백질 분석 시약 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
4. em>6.4전기영동: 50μg 단백질 샘플을 로드하고 12% 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서 분리합니다.
5. 멤브레인으로 이동: 전기영동 전달 시스템을 사용하여 PVDF 멤브레인으로 전기영동으로 전달합니다.
6. 멤브레인 세분화: 멤브레인을 세분화하고 단일 전달에서 관심 단백질인 β-actin 및 GAPDH를 각각 분석합니다.
7. 차단: 실온에서 5% 무지방 우유를 함유한 TBST에서 1시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
8. 1차 항체 배양: 절단된 카스파제-9(1:200 희석), 절단된 카스파제-3(1:200 희석), 절단된 카스파제-7(1:200 희석) 및 β-actin(1:1000 희석)의 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다. TBST로 멤브레인을 5분 동안 세척하고 3회 반복합니다.
9. 두 번째 항체 배양: 실온에서 2시간 동안 horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (1:2000)를 사용하여 배양합니다. TBST로 멤브레인을 5분 동안 세척하고 3회 반복합니다.
10. 노출: 웨스턴 블롯 기질을 사용하여 표지된 단백질을 시각화하고, 마지막으로 멤브레인을 노출시켜 자동 노출 모드에서 단백질 밴드를 시각화합니다.
11. 단백질 밴드 밀도를 측정하여 단백질 함량⁷ 을 계산합니다.

7. 통계 분석

1. SPSS 19.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 이를 표준 편차± 평균으로 제시합니다. 분산의 일원 분석을 사용하여 관측된 값에 대한 통계 분석을 수행합니다. p< 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

결과

HE 염색 후 대조군에 있는 쥐의 모든 망막층은 명확한 조직 구조, 질서 있는 세포 배열 및 균일한 염색을 보인 반면, 모델 그룹에 있는 쥐의 망막 구조는 크게 손상되고 외부 망막층은 더 얇아졌으며 외부 핵층은 내부 코어층과 거의 완전히 통합되었으며 층 내 세포의 배열은 매우 무질서했습니다. 세포층의 수가 현저히 감소하였고, 감광성 세포층과 외부 핵층의 두께가 ?...

토론

RP는 클리닉에서 흔히 볼 수 있는 망막 질환입니다. RP의 발병, 중증도 및 진행은 유전자 및 유전적 양태와 관련이 있으며 환경의 영향을 받는다 ^8,11. RP에는 가족성 RP와 간헐적 RP가 포함되며, 이 중 가족성 RP가 환자의 약 60%를 차지합니다. 가족의 유전적 병력을 추적한 결과, 현재까지 RP와 관련된 유전자는 83개이며, 간헐적인 RP?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970