N-metil-N-nitrosourea ile İndüklenen Sıçan Retina Hasarının Örneklenmesi ve Patolojik Değişikliklerin Çok İndeksli Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, sıçan retinal örneklemesi ve N-Metil-N-Nitrosourea'nın intraperitoneal enjeksiyonundan sonra retinadaki patolojik değişiklikleri ve apoptozu tespit etmek için hematoksilen-eozin boyama, TUNEL testi ve Western blot kullanımı için bir prosedürü tanımlar.

Özet

Retinopati, çoğu oküler hastalıkta ve diabetes mellitusun geç komplikasyonlarında görülebilir. Spesifik pigment epitel hücreleri ve optik hücrelerin hasar görmesi ve dejenerasyonu retinopatinin temel özellikleridir. Birçok geleneksel ilaç, retinopatinin tedavisinde önemli klinik etkinlik göstermiştir. Bir retinanın hızlı ve eksiksiz bir şekilde nasıl elde edileceği, retinopati tedavisi için geleneksel tıp araştırmalarında önemli bir adımdır. Bu çalışmada, N-metil-N-nitrosourea (MNU) ile indüklenen sıçanların retina hasarının örneklenmesi ve patolojik değişikliklerin çok indeksli değerlendirilmesi için standart ve uygulanabilir bir prosedür sağlamayı amaçladık. Sıçanlara retina hasarını indüklemek için bir kez intraperitoneal olarak 60 mg / kg MNU enjekte edildi ve retina örnekleri 7 gün sonra elde edildi. Ek olarak, retinal patolojik değişiklikleri değerlendirmek için hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Apoptoz oranı ve apoptoz proteininin TUNEL ve Western blot ile belirlenmesi. Retina örneklemesi ve patolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için bu standartlaştırılmış protokoller, retinopati mekanizmasının araştırılmasında ve yeni ve etkili geleneksel bitkilerin keşfinde yardımcı olmaktadır.

Giriş

Retinitis pigmentosa (RP) kalıtsal ve kör edici bir retina hastalığıdır¹. RP'nin görülme sıklığı 1/3500 ile 1/5000 arasındadır ve dünyada yaklaşık 2,5 milyon kişinin görme fonksiyonunu etkilemektedir. İnsanda görme bozukluğuna yol açan, tüm topluma önemli bir yük getiren en yaygın hastalıklardan biridir². Hastalık, retina pigment epitel hücre fonksiyonunun kademeli kaybı ve fotoreseptörlerin ilerleyici apoptozu ile karakterizedir. Erken evrede, hastalar periferik görme alanı kusurları olarak ortaya çıkan ve sonunda merkezi görme kaybına yol açan gece körlüğü yaşarlar³. Bu nedenle, retinal fotoreseptör apoptozunun inhibisyonu, RP'nin önlenmesi ve tedavisi için önemli bir noktadır.

Retinal hücreli apoptoz, insan RP ve model hayvanların ortak bir özelliğidir⁴. Sıçanlarda 7 gün boyunca 60 mg / kg N-Metil-N-Nitrosourea (MNU) intraperitoneal enjeksiyonu, apoptozu ve retinal fotoreseptör hücrelerinin kaybını indükleyebilir ve RP ^5,6'nın yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir. Model hayvanlarda retina dokusunun patolojik yapısı, spesifik hücre apoptozu ve apoptozla ilişkili protein ekspresyonundaki değişikliklerin analiz edilmesi, insan RP ve tarama ilaçlarının patogenezinin incelenmesinde etkili deneysel veriler ve teorik destek sağlayabilir ^7,8. Bu nedenle, retina örneklerinin kalitesi deneysel verilerin güvenilirliğini belirler. Bununla birlikte, oküler dokunun özelliği nedeniyle, sıçan retinasının nasıl elde edileceğine dair çok az rapor vardır⁹.

Bu makale, yukarıdaki eksikliklerin üstesinden gelmek için sıçanlarda retina örneklemesi için basit, hızlı, standartlaştırılmış ve uygulanabilir bir prosedür sunmaktadır. Sıçanlarda retina dokusu hasarı ve apoptozdaki patolojik değişiklikleri analiz etmek için hematoksilen-eozin boyaması (HE), terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı deoksiuridin trifosfat-digoksigenin çentik-uç etiketleme (TUNEL) boyaması ve Western blot kullanılır. Tüm yöntemler, araştırma grubumuzun belirli operasyonel süreçlerle ilgili deneyiminden türetilmiştir.

Protokol

Tüm protokoller ve cerrahi prosedürler Ningxia Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Etik numarası: NO. 2020-Q066). 7-8 haftalık ve 200-220 g ağırlığındaki SPF Sprauge-Dawley (SD) erkek sıçanlar, SCXK (Ning) 2020-0001 hayvan lisans numarası ile Ningxia Tıp Üniversitesi'nden satın alındı. Tüm hayvanlar Ningxia Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Merkezinde yetiştirildi. Sıcaklık ve nem uygundu, gündüz-gece ışık döngüsü korundu ve yiyecek ve su serbest ve yeterliydi.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. Sıçan plakaları, inhalasyon anestezi cihazları, gömülü kutular, donmuş saklama tüpleri, tek kullanımlık cerrahi eldivenler ve maskeler, geniş ağızlı şişeler, %4 paraformaldehit, buz paketleri, oftalmik makas, oftalmik cımbız, cerrahi bıçaklar ve bıçak sapları, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve bunları önceden sterilize edin (bkz.
2. Hayvan hazırlama
   1. 20 erkek SD sıçanı rastgele model grubuna (n = 10) ve kontrol grubuna (n = 10) bölün. Model sıçanlara intraperitoneal olarak 60 mg / kg MNU enjekte edin ve kontrol sıçanlarına aynı hacimde salin ile intraperitoneal olarak enjekte edin.
   2. Enjeksiyondan 7 gün sonra, fareleri aç ve örneklemeden önceki gece serbestçe içmelerine izin verin.
   3. Ertesi gün, sıçanı ameliyat masasına sırtüstü yatırın ve% 4 izofluran ve 2 L / dak oksijen kullanarak anestezi uygulamak için bir maske kullanın. Sıçanların tepkilerini gözlemlemek için ayağın merkezini sıkıştırarak anestezi derinliğini ölçün.

2. Protein faktörü tespiti için retina örneklemesi

1. Sıçanın göz yuvasını sol elinizle sabitleyin ve oftalmik bükme forseps kullanarak sağ elinizle orta kuvvetle gözü çıkarın. Göz küresini soğuk bir cam tabağa sagital pozisyonda yerleştirin.
2. Sol el göz küresini sabitlemek için oftalmik düz cımbız tutarken ve sağ el cerrahi bıçağı tutarken, lens bölgesinin yakınında 2 mm uzunlamasına bir kesi yapın.
3. Kesi boyunca oftalmik makasla korneayı kesin ve lensi, vitreusu nazikçe soyun ve göz kapağını açıkta bırakın.
4. Göz kabının altını 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün ucuna yerleştirin, göz kabını tüpün üzerine çevirin ve retinayı açığa çıkarın (retina soluk sarıdır).
5. Oftalmik bükme cımbızıyla göz küresinin skleral duvarı boyunca tüm retinayı çıkarın, ardından donmuş bir tüpe koyun ve ileride kullanmak üzere sıvı nitrojen tankında saklayın (Şekil 1).

3. Patolojik inceleme ve spesifik hücre boyama için retina örneklemesi

1. Sol elinizle, farenin gözünün köşesini kaldırmak için göz cımbızını kullanın. Sağ elinizle, farenin gözünün köşesi boyunca 4 mm'lik bir açıklık kesmek için cerrahi bir bıçak kullanın.
2. Sol eldeki açıklıkta göz küresinin kenarını sıkıştırmak için göz cımbızını kullanın. Göz küresinin çevresindeki dokuları temizlemeye dikkat ederken, göz küresinin kenarı boyunca çevre dokuları kesmek için oftalmik makas kullanın.
3. Göz küresinin arka kutbunda yer alan görme sinirinin etrafındaki dokuları cımbız ile ayırın, göz sinirini kesin ve korumaya dikkat edin. Ardından göz küresini çıkarın.
4. Kalan kanı çıkarmak için çıkarılan göz küresini tuzlu suyla yıkayın, fazla suyu emmek için filtre kağıdına sarın ve soğuk kalay folyo üzerine yerleştirin.
5. Gözü oftalmik cımbızla düzeltin. Cerrahi bir bıçakla kornea ve retinanın birleştiği yer boyunca 4 mm'lik uzunlamasına bir kesi yapın.
6. Korneayı oftalmik makasla çıkarın, kesi boyunca dairesel bir kesim yapın ve lensi ve vitreus gövdesini nazikçe çıkarın.
7. Optik sinirli kalan göz kapağını bir gömme kutusuna yerleştirin ve %4 paraformaldehit ile sabitleyin.
8. Paraformaldehit ile sabitlenmiş numuneleri parafine gömün ve HE boyama ve TUNEL boyama⁷ için 4 μm'lik dilimler halinde kesin.

4. Sıçan retinasının HE boyanması

1. Mum alma ve hidrasyon: Dilimleri 10 dakika ksilen içine yerleştirin, işlemi 10 dakika daha tekrarlayın, ardından 5 dakika mutlak etanol uygulayın, etanol işlemini 5 dakika daha tekrarlayın, ardından 5 dakika boyunca% 95 alkolde muamele edin, daha sonra% 85 alkolde 5 dakika ve son olarak 5 dakika% 75 alkolde.
2. Hematoksilen boyama: Dilimi deiyonize su ile 5 dakika durulayın. 100 μL hematoksilen boyama solüsyonu kullanın ve 5 dakika boyayın, 5-10 saniye deiyonize su ile durulayın. 30 saniye boyunca 100 μL %1 hidroklorik asit etanol ekleyin, 20 dakika deiyonize su ile durulayın ve 1 dakika boyunca 100 μL %0.2 amonyaklı su ekleyin. Deiyonize su ile 5 dakika durulayın.
3. Eozin boyama: 5 dakika boyunca lekelemek için 100 μL eozin boyama solüsyonu kullanın ve 30 saniye boyunca deiyonize su ile durulayın.
4. Dehidrasyon ve sızdırmazlık: Dilimleri 5 dakika boyunca %70 alkole, ardından 5 dakika boyunca %85 alkole, ardından 5 dakika boyunca %90 alkole ve 5 dakika mutlak etanole batırın. Mutlak etanol işlemini 5 dakika daha tekrarlayın, ardından 5 dakika ksilene batırın ve işlemi 5 dakika daha tekrarlayın. Son olarak, dilimlerin yüzeyine yaklaşık 100 μL nötr reçine ekleyerek kapatın ve ardından bir kapak camı ile örtün.
5. Slaytları görüntüleme: Lekeli dilimleri mikroskobun üzerine yerleştirin, görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 400x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.
6. Toplam retina kalınlığını ve dış retina kalınlığını ölçün: Toplam retina kalınlığını ve dış retina kalınlığını (dış nükleer tabakanın ve fotoreseptör tabakasının kalınlığı) ölçün ve dış retina kalınlığı yüzdesini hesaplayın
   Dış retina kalınlığı (%) = (dış retina kalınlığı / toplam retina kalınlığı) x 100.

5. Retinal fotoreseptör hücrelerin apoptoz oranının TUNEL yöntemi ile belirlenmesi

1. Mum alma ve hidrasyon: Dilimleri 10 dakika ksile içine yerleştirin, işlemi 10 dakika daha tekrarlayın, ardından 5 dakika mutlak etanol içine koyun ve bu adımı 5 dakika daha tekrarlayın. 5 dakika boyunca %95 alkol, 5 dakika boyunca %90 alkol, 5 dakika boyunca %80 alkol, 5 dakika boyunca %70 alkol koyarak dehidrasyon yapın ve 5 dakika boyunca deiyonize su ile durulayın.
2. % 0.85 sodyum klorür çözeltisi ile 5 dakika ve PBS ile 5 dakika durulayın. 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak paraformaldehit ile sabitleyin. PBS ile 5 dakika durulayın ve işlemi 5 dakika daha tekrarlayın.
3. İnkübasyon ve dengeleme⁷: Sindirim için 20 μg/mL proteinaz K çözeltisi ile 15 dakika inkübe edin, denge tamponunda 10 dakika dengeleyin ve rekombinant terminal deoksinükleidiltransferaz (rTdT) tamponu ile 37 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
4. Reaksiyonu durdurma: 15 dakika boyunca 100 μL standart sitrat çözeltisi (2x SSC çözeltisi) ekleyin. PBS ile 5 dakika durulayın ve işlemi 5 dakika daha tekrarlayın.
5. Nükleer boya: 5 dakika boyunca 100 μL 4 ", 6-diamidin-2-fenindl (DAPI) reaktifi ekleyin. Deiyonize su ile 5 dakika yıkayın ve işlemi 5 dakika daha tekrarlayın.
6. Mühür: Dilimlerin etrafındaki fazla ksileni silin ve dilimlerin yüzeyine yaklaşık 100 μL nötr reçine ekleyerek kapatın ve ardından bir kapak camı ile örtün.
7. Mikroskopi: Lekeli dilimleri mikroskobun üzerine yerleştirin, net görünürlük için mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 400x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın. Standart bir floresan filtresi kullanarak 520 ± 20 nm'de yeşil floresansı gözlemleyin. Mavi DAPI'yi 460 nm'de gözlemleyin.
8. Apoptoz oranını hesaplayın: dış retina çekirdek tabakasının yeşil floresan değerlerini ve mavi floresan değerlerini ölçün. Apoptoz oranını şu şekilde hesaplayın:
   Apoptoz hücre hızı = yeşil floresan değeri/mavi floresan değeri x 100.

6. Batı lekesi analizi ¹⁰

1. Lizis tamponu tedavisi: 50 μL soğuk lizis tamponu (5 μL fosfataz inhibitörü, 1 μL proteaz inhibitörü ve 5 μL 100 mM PMSF içeren 1 mL lizis tamponu) ile donmuş bir retinayı doğrayın ve homojenize edin.
2. Bir buz banyosunda 5 saniye boyunca 28 kHz sonikasyona tabidir; 3x tekrarlayın. Hücresel kalıntıları gidermek için 4 °C'de 5 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı koruyun.
3. em>6.3 Proteinin miktar tayini: Bir BCA protein tahlil reaktif kiti kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
4. em>6.4 Elektroforez: 50 μg protein numunesi yükleyin ve %12 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine ayırın.
5. Membrana transfer: Elektroforetik bir transfer sistemi kullanarak PVDF membranlara elektroforetik olarak transfer.
6. Zarları alt bölümlere ayırın: Zarları alt bölümlere ayırın ve ilgilenilen her proteini, β-aktin ve GAPDH'yi tek bir transferden analiz edin.
7. Blokaj: Oda sıcaklığında %5 yağsız süt içeren TBST'de membranları 1 saat bloke edin.
8. Birincil antikoru inkübe edin: Bölünmüş kaspaz-9 (1:200 seyreltme), bölünmüş kaspaz-3 (1:200 seyreltme), bölünmüş kaspaz-7 (1:200 seyreltme) ve β-aktin (1:1000 seyreltme) primer antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Membranları TBST ile 5 dakika yıkayın, 3x tekrarlayın.
9. İkinci antikoru inkübe edin: Yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorları (1:2000) ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Membranları TBST ile 5 dakika yıkayın, 3x tekrarlayın.
10. Pozlama: Western blot substratını kullanarak etiketli proteinleri görselleştirin ve son olarak, protein bantlarını otomatik pozlama modunda görselleştirmek için zarları açığa çıkarın.
11. Protein bandı yoğunluğunu ölçerek protein içeriğini⁷ hesaplayın.

7. İstatistiksel analiz

1. SPSS 19.0 yazılımını kullanarak verileri analiz edin ve ortalama ± standart sapma olarak sunun. Tek yönlü varyans analizini kullanarak gözlemlenen değerlerin istatistiksel analizlerini gerçekleştirin. İstatistiksel olarak anlamlı olarak p< 0.05'i alın.

Sonuçlar

HE boyamadan sonra, kontrol grubundaki sıçanların tüm retina katmanları net doku yapısına, düzenli hücre düzenlemesine ve düzgün boyamaya sahipken, model grubundaki sıçanların retinal yapısı önemli ölçüde hasar gördü, dış retina tabakası daha inceydi, dış nükleer tabaka neredeyse tamamen iç çekirdek tabakası ile bütünleşmişti, tabakadaki hücrelerin düzeni son derece düzensizdi, Hücre katmanlarının sayısı önemli ölçüde azaldı ve ışığa ...

Tartışmalar

RP kliniklerde sık görülen bir retina hastalığıdır. RP'nin başlangıcı, şiddeti ve ilerlemesi genler ve genetik modlarla ilgilidir ve çevreden etkilenir ^8,11. RP, ailesel RP ve sıklıkla RP'yi içerir ve ailesel RP hastaların yaklaşık %60'ını oluşturur. Aile genetik geçmişinin izlenmesi yoluyla, şimdiye kadar RP ile ilgili 83 gen tanımlanmışken, ara sıra RP yaklaşık %40'ını oluşturur, bu da bu tür b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970