Muestreo de daño en la retina de rata inducido por N-metil-N-nitrosourea y evaluación multiíndice de cambios patológicos

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para la toma de muestras de retina en ratas y la utilización de la tinción con hematoxilina-eosina, el ensayo TUNEL y el Western blot para detectar cambios patológicos y apoptosis en la retina después de la inyección intraperitoneal de N-metil-N-nitrosourea.

Resumen

La retinopatía se puede observar en la mayoría de las enfermedades oculares y las complicaciones tardías de la diabetes mellitus. El daño y la degeneración de las células epiteliales pigmentarias específicas y las células ópticas son las principales características de la retinopatía. Muchas medicinas tradicionales han demostrado una eficacia clínica sustancial en el tratamiento de la retinopatía. Cómo obtener una retina de forma rápida y completa es un paso clave en la investigación de la medicina tradicional para el tratamiento de la retinopatía. En este estudio, nuestro objetivo es proporcionar un procedimiento estandarizado y ejercitable para la toma de muestras del daño en la retina de rata inducido por N-metil-N-nitrosourea (MNU) y la evaluación multiíndice de los cambios patológicos. A las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal 60 mg/kg de MNU una vez para inducir daño en la retina, y se obtuvieron muestras de retina después de 7 días. Además, realizamos una tinción de hematoxilina-eosina para evaluar los cambios patológicos de la retina. Determinación de la tasa de apoptosis y de la proteína de apoptosis por TUNEL y Western blot. Estos protocolos estandarizados para la toma de muestras de retina y la evaluación de cambios patológicos son útiles para promover la exploración del mecanismo de la retinopatía y el descubrimiento de hierbas tradicionales novedosas y efectivas.

Introducción

La retinosis pigmentaria (RP) es una enfermedad hereditaria y cegadora^de la retina 1. La incidencia de RP es de entre 1/3500 y 1/5000, afectando a la función visual de unos 2,5 millones de personas en el mundo. Es una de las enfermedades más conocidas que conducen a la discapacidad visual en los seres humanos, imponiendo una carga significativa a toda la sociedad². La enfermedad se caracteriza por la pérdida gradual de la función de las células epiteliales pigmentarias de la retina y la apoptosis progresiva de los fotorreceptores. En la etapa inicial, los pacientes experimentan ceguera nocturna, que se manifiesta como defectos del campo visual periférico y, finalmente, conduce a la pérdida de la visión central³. Por lo tanto, la inhibición de la apoptosis de los fotorreceptores de la retina es el punto de referencia para la prevención y el tratamiento de la RP.

La apoptosis de las células de la retina es una característica común de la RP humana y de los animales modelo⁴. La inyección intraperitoneal de 60 mg/kg de N-metil-N-nitrosourea (MNU) en ratas durante 7 días puede inducir apoptosis y pérdida de células fotorreceptoras de la retina, y es un modelo animal de RP ^5,6 comúnmente utilizado. El análisis de los cambios en la estructura patológica, la apoptosis celular específica y la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis del tejido de la retina en animales modelo puede proporcionar datos experimentales efectivos y apoyo teórico en el estudio de la patogénesis de la RP humana y los fármacos de cribado ^7,8. Por lo tanto, la calidad de los especímenes de retina determina la fiabilidad de los datos experimentales. Sin embargo, debido a la particularidad del tejido ocular, existen muy pocos reportes sobre cómo obtener la retina de rata⁹.

Este documento proporciona un procedimiento simple, rápido, estandarizado y operable para el muestreo de retina en ratas para superar las deficiencias anteriores. La tinción con hematoxilina-eosina (HE), la tinción con desoxinucleotidil transferasa terminal mediada por desoxinucleotidil transferasa desoxiuridina trifosfato-digoxigenina (TUNEL) y Western blot se utilizan para analizar los cambios patológicos en el daño tisular de la retina y la apoptosis en las ratas. Todos los métodos se derivan de la experiencia de nuestro grupo de investigación con los procesos operativos específicos.

Protocolo

Todos los protocolos y procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Ningxia (Número de ética: NO. 2020-Q066). Se compraron ratas macho SPF Sprauge-Dawley (SD), de 7-8 semanas de edad y con un peso de 200-220 g, de la Universidad Médica de Ningxia con el número de licencia animal SCXK (Ning) 2020-0001. Todos los animales fueron criados en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Ningxia. La temperatura y la humedad eran adecuadas, el ciclo de luz día-noche se mantenía y la comida y el agua eran gratuitos y suficientes.

1. Preparación preoperatoria

1. Preparación de materiales
   1. Prepare placas para ratas, dispositivos de anestesia inhalatoria, cajas incrustadas, tubos de almacenamiento congelados, guantes y mascarillas quirúrgicas desechables, botellas de boca ancha, paraformaldehído al 4%, bolsas de hielo, tijeras oftálmicas, pinzas oftálmicas, cuchillas quirúrgicas y mangos de cuchillos, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y esterilícelos con anticipación (consulte la tabla de materiales).
2. Preparación animal
   1. Divida aleatoriamente 20 ratas SD macho en un grupo modelo (n = 10) y un grupo de control (n = 10). Inyectar a las ratas modelo por vía intraperitoneal 60 mg/kg de MNU e inyectar a las ratas de control por vía intraperitoneal el mismo volumen de solución salina.
   2. Después de 7 días de la inyección, ayune las ratas y déjelas beber libremente la noche anterior a la toma de muestras.
   3. Al día siguiente, coloque la rata en decúbito supino en la mesa de operaciones y use una máscara para administrar la anestesia con isoflurano al 4% y oxígeno 2 L/min. Mida la profundidad de la anestesia pellizcando el centro del pie para observar las reacciones de las ratas.

2. Toma de muestras de retina para la detección de factores proteicos

1. Fije la cuenca del ojo de la rata con la mano izquierda y retire el ojo con fuerza moderada con la mano derecha utilizando una pinza de flexión oftálmica. Coloque el globo ocular en posición sagital en un plato de vidrio frío.
2. Con la mano izquierda sosteniendo pinzas rectas oftálmicas para fijar el globo ocular y la mano derecha sosteniendo la cuchilla quirúrgica, haga una incisión longitudinal de 2 mm cerca del sitio de la lente.
3. Corte la córnea con las tijeras oftálmicas a lo largo de la incisión y retire suavemente el cristalino, el vítreo y exponga la copa del ojo.
4. Coloque la parte inferior del ocular en la punta del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, gire el ocular sobre el tubo y exponga la retina (la retina es de color amarillo tenue).
5. Extraiga toda la retina a lo largo de la pared escleral del globo ocular con pinzas oftálmicas de flexión, luego colóquela en un tubo congelado y guárdela en un tanque de nitrógeno líquido para uso futuro (Figura 1).

3. Toma de muestras de retina para examen anatomopatológico y tinción de células específicas

1. Con la mano izquierda, usa las pinzas para levantar el rabillo del ojo de la rata. Con la mano derecha, use una cuchilla quirúrgica para cortar una abertura de 4 mm a lo largo de la esquina del ojo de la rata.
2. Use las pinzas para sujetar el borde del globo ocular en la abertura de la mano izquierda. Use tijeras oftálmicas para cortar los tejidos circundantes a lo largo del borde del globo ocular mientras presta atención a la limpieza de los tejidos circundantes del globo ocular.
3. Separe los tejidos alrededor del nervio óptico en el polo posterior del globo ocular con pinzas para los ojos, corte el nervio óptico y preste atención a preservarlo. A continuación, retira el globo ocular.
4. Lave el globo ocular extraído con solución salina para eliminar la sangre restante, enróllelo sobre papel de filtro para absorber el exceso de agua y colóquelo sobre papel de aluminio frío.
5. Fijar el ojo con pinzas oftálmicas. Realice una incisión longitudinal de 4 mm a lo largo de la unión de la córnea y la retina con una cuchilla quirúrgica.
6. Retire la córnea con unas tijeras oftálmicas, haga un corte circular a lo largo de la incisión y retire suavemente el cristalino y el cuerpo vítreo.
7. Coloque el ocular restante con un nervio óptico en una caja de inclusión y fíjelo en paraformaldehído al 4%.
8. Incrustar muestras fijadas con paraformaldehído en parafina y cortar en rodajas de 4 μm para la tinción HE y la tinción TUNEL⁷.

4. Tinción de HE en retina de rata

1. Desparafinado e hidratación: Coloque las rodajas en xileno durante 10 minutos, repita el proceso durante otros 10 minutos, seguido de etanol absoluto durante 5 minutos, repita el tratamiento con etanol durante otros 5 minutos, seguido de un tratamiento con alcohol al 95% durante 5 minutos, luego con alcohol al 85% durante 5 minutos y finalmente con alcohol al 75% durante 5 minutos.
2. Tinción con hematoxilina: Enjuague la rodaja con agua desionizada durante 5 min. Utilice 100 μL de solución de tinción de hematoxilina y tinte durante 5 minutos, enjuague con agua desionizada durante 5-10 s. Añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 1% durante 30 s, enjuagar con agua desionizada durante 20 min y añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 1 min. Enjuague con agua desionizada durante 5 min.
3. Tinción con eosina: Utilice 100 μL de solución de tinción con eosina para teñir durante 5 min y enjuague con agua desionizada durante 30 s.
4. Deshidratación y sellado: Sumerja las rodajas en alcohol al 70% durante 5 minutos, luego al 85% de alcohol durante 5 minutos, seguido de alcohol al 90% durante 5 minutos y etanol absoluto durante 5 minutos. Repita el tratamiento con etanol absoluto durante otros 5 minutos, luego sumérjalo en xileno durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos. Por último, selle añadiendo aproximadamente 100 μL de resina neutra a la superficie de las lonchas y luego cúbralo con un cubreobjetos.
5. Obtención de imágenes de los portaobjetos: Coloque las rodajas teñidas en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 400x y capture la imagen.
6. Mida el grosor total de la retina y el grosor externo de la retina: Mida el grosor total de la retina y el grosor externo de la retina (espesor de la capa nuclear externa y la capa fotorreceptora) y calcule el porcentaje de espesor de la retina externa
   Espesor de la retina externa (%) = (espesor de la retina externa/espesor total de la retina) x 100.

5. Determinación de la tasa de apoptosis de las células fotorreceptoras de la retina con el método TUNEL

1. Desparafinado e hidratación: Coloque las rodajas en xileno durante 10 minutos, repita el proceso durante otros 10 minutos, luego colóquelas en etanol absoluto durante 5 minutos y repita este paso durante otros 5 minutos. Realice la deshidratación colocando alcohol al 95% durante 5 minutos, alcohol al 90% durante 5 minutos, alcohol al 80% durante 5 minutos, alcohol al 70% durante 5 minutos y enjuague con agua desionizada durante 5 minutos.
2. Enjuague con solución de cloruro de sodio al 0,85% durante 5 min y PBS durante 5 min. Fijar con paraformaldehído usando paraformaldehído al 4% durante 15 min. Enjuague con PBS durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos.
3. Incubación y equilibrio⁷: Incubar con 20 μg/mL de proteinasa K solución para digestión durante 15 min, equilibrar en el tampón de equilibrio durante 10 min e incubar con tampón de desoxinucleotidiltransferasa terminal recombinante (rTdT) a 37 °C durante 60 min.
4. Reacción de parada: Añadir 100 μL de la solución de citrato estándar (2x solución de SSC) durante 15 min. Enjuague con PBS durante 5 minutos y repita el proceso durante otros 5 minutos.
5. Colorante nuclear: Agregue 100 μL 4 ', reactivo de 6-diamidina-2-fenindl (DAPI) durante 5 min. Lavar con agua desionizada durante 5 minutos y repetir el proceso durante otros 5 minutos.
6. Sellado: Limpie el exceso de xileno alrededor de las rodajas y selle agregando aproximadamente 100 μL de resina neutra a la superficie de las rodajas, y luego cúbralo con un cubreobjetos.
7. Microscopía: Coloque las rodajas teñidas en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, establezca el aumento en 400x y capture la imagen. Observe la fluorescencia verde a 520 ± 20 nm utilizando un filtro de fluorescencia estándar. Observe el DAPI azul a 460 nm.
8. Calcule la tasa de apoptosis: mida los valores de fluorescencia verde y los valores de fluorescencia azul de la capa externa del núcleo de la retina. Calcule la tasa de apoptosis como
   Tasa de células de apoptosis = valor de fluorescencia verde/valor de fluorescencia azul x 100.

6. Análisis de Western blot ¹⁰

1. Tratamiento con tampón de lisis: Picar y homogeneizar una retina congelada con 50 μL de tampón de lisis en frío (1 mL de tampón de lisis que contiene 5 μL de inhibidor de la fosfatasa, 1 μL de inhibidor de la proteasa y 5 μL de 100 mM de PMSF).
2. Sujeto a una sonicación de 28 kHz durante 5 s en un baño de hielo; Repita 3 veces. Centrifugar a 4 °C durante 5 min a 10.000 x g para eliminar los residuos celulares. Conserva el sobrenadante.
3. em>6.3Cuantificación de proteínas: Determine la concentración de proteínas utilizando un kit de reactivos de ensayo de proteínas BCA.
4. em>6.4Electroforesis: Cargue una muestra de proteína de 50 μg y sepárela en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio al 12% (SDS-PAGE).
5. Transferencia a membrana: Transferencia electroforética a membranas de PVDF mediante un sistema de transferencia electroforética.
6. Subdividir membranas: Subdividir las membranas y analizar cada proteína de interés, β-actina y GAPDH de una sola transferencia.
7. Bloqueo: Bloquear las membranas durante 1 h en TBST que contenga un 5% de leche descremada a temperatura ambiente.
8. Incubar el anticuerpo primario: Incubar con el anticuerpo primario de caspasa-9 escindida (dilución 1:200), caspasa-3 escindida (dilución 1:200), caspasa-7 escindida (dilución 1:200) y β-actina (dilución 1:1000) durante la noche a 4 °C. Lave las membranas con TBST durante 5 minutos, repita 3 veces.
9. Incubar el segundo anticuerpo: Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:2000) durante 2 h a temperatura ambiente. Lave las membranas con TBST durante 5 minutos, repita 3 veces.
10. Exposición: Visualice las proteínas marcadas utilizando el sustrato Western blot y, por último, exponga las membranas para visualizar las bandas de proteínas en un modo de exposición automático.
11. Calcule el contenido de proteína⁷ midiendo la densidad de bandas de proteína.

7. Análisis estadístico

1. Analice los datos con el software SPSS 19.0 y preséntelos como la media ± la desviación estándar. Realice análisis estadísticos de los valores observados utilizando el análisis de varianza unidireccional. Tome p< 0.05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Después de la tinción de HE, todas las capas de la retina de las ratas en el grupo de control tenían una estructura de tejido clara, una disposición ordenada de las células y una tinción uniforme, mientras que la estructura de la retina de las ratas en el grupo modelo estaba significativamente dañada, la capa externa de la retina era más delgada, la capa nuclear externa estaba casi completamente integrada con la capa central interna, la disposición de las células en la capa era...

Discusión

La RP es una enfermedad de la retina común en las clínicas. El inicio, la gravedad y la progresión de la RP están relacionados con los genes y los modos genéticos y se ven afectados por el medio ambiente ^8,11. La RP incluye la RP familiar y la RP ocasional, de las cuales la RP familiar representa alrededor del 60% de los pacientes. A través del rastreo de los antecedentes genéticos familiares, hasta el momento se han ident...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970