Probenahme von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff-induzierten Netzhautschäden von Ratten und Multi-Index-Bewertung pathologischer Veränderungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Probenahme der Netzhaut bei Ratten und unter Verwendung von Hämatoxylin-Eosin-Färbung, TUNEL-Assay und Western Blot zum Nachweis pathologischer Veränderungen und Apoptose in der Netzhaut nach intraperitonealer Injektion von N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff.

Zusammenfassung

Die Retinopathie kann bei den meisten Augenerkrankungen und den Spätkomplikationen des Diabetes mellitus beobachtet werden. Die spezifischen Schädigung und Degeneration der Pigmentepithelzellen und der Sehzellen sind die Hauptmerkmale der Retinopathie. Viele traditionelle Arzneimittel haben eine erhebliche klinische Wirksamkeit bei der Behandlung von Retinopathie gezeigt. Die schnelle und vollständige Gewinnung einer Netzhaut ist ein wichtiger Schritt in der traditionellen Medizin zur Behandlung der Retinopathie. In dieser Studie wollen wir ein standardisiertes und ausführbares Verfahren für die Probenahme von N-Methyl-N-nitrosoharnstoff (MNU)-induzierten Netzhautschäden von Ratten und die Multi-Index-Bewertung pathologischer Veränderungen bereitstellen. Ratten wurden einmal intraperitoneal mit 60 mg/kg MNU injiziert, um eine Netzhautschädigung zu induzieren, und Netzhautproben wurden nach 7 Tagen entnommen. Zusätzlich führten wir Hämatoxylin-Eosin-Färbungen durch, um pathologische Veränderungen der Netzhaut zu beurteilen. Bestimmung der Apoptoserate und des Apoptoseproteins mittels TUNEL und Western Blot. Diese standardisierten Protokolle für die Probenahme der Netzhaut und die Bewertung pathologischer Veränderungen sind hilfreich, um die Erforschung des Mechanismus der Retinopathie und die Entdeckung neuer und wirksamer traditioneller Kräuter zu fördern.

Einleitung

Die Retinitis pigmentosa (RP) ist eine erbliche und erblindende Netzhauterkrankung¹. Die Inzidenz von RP liegt zwischen 1/3500 und 1/5000 und beeinträchtigt die Sehfunktion von etwa 2,5 Millionen Menschen auf der Welt. Es ist eine der bekanntesten Krankheiten, die beim Menschen zu Sehbehinderungen führt und eine erhebliche Belastung für die gesamte Gesellschaft darstellt². Die Krankheit ist gekennzeichnet durch den allmählichen Verlust der Funktion der retinalen Pigmentepithelzellen und die fortschreitende Apoptose der Photorezeptoren. Im Frühstadium kommt es bei den Patienten zu einer Nachtblindheit, die sich in peripheren Gesichtsfeldausfällen äußert und schließlich zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt³. Daher ist die Hemmung der retinalen Photorezeptor-Apoptose der Ausgangspunkt für die Prävention und Behandlung von RP.

Die Apoptose von Netzhautzellen ist ein gemeinsames Merkmal von menschlichem RP und Modelltieren⁴. Die intraperitoneale Injektion von 60 mg/kg N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU) bei Ratten über einen Zeitraum von 7 Tagen kann Apoptose und Verlust von retinalen Photorezeptorzellen induzieren und ist ein häufig verwendetes Tiermodell von RP ^5,6. Die Analyse der Veränderungen der pathologischen Struktur, der spezifischen Zellapoptose und der Apoptose-bedingten Proteinexpression von Netzhautgewebe bei Modelltieren kann effektive experimentelle Daten und theoretische Unterstützung bei der Untersuchung der Pathogenese von humanem RP und Screening-Medikamenten liefern ^7,8. Daher bestimmt die Qualität der Netzhautproben die Zuverlässigkeit der experimentellen Daten. Aufgrund der Besonderheit des Augengewebes gibt es jedoch nur sehr wenige Berichte darüber, wie man die Netzhaut der Ratte^{bekommt 9}.

Dieses Papier bietet ein einfaches, schnelles, standardisiertes und bedienbares Verfahren für die Netzhautprobenahme bei Ratten, um die oben genannten Mängel zu überwinden. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE), die terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridin-Triphosphat-Digoxigenin-Nick-End-Markierung (TUNEL) und der Western-Blot werden verwendet, um die pathologischen Veränderungen der retinalen Gewebeschädigung und Apoptose bei den Ratten zu analysieren. Alle Methoden leiten sich aus den Erfahrungen unserer Forschungsgruppe mit den spezifischen betrieblichen Prozessen ab.

Protokoll

Alle Protokolle und chirurgischen Eingriffe wurden von der Ethikkommission der Ningxia Medical University genehmigt (Ethiknummer: Nr. 2020-Q066). Männliche Ratten mit SPF Sprauge-Dawley (SD) im Alter von 7-8 Wochen und einem Gewicht von 200-220 g wurden von der Ningxia Medical University mit der Tierlizenznummer SCXK (Ning) 2020-0001 gekauft. Alle Tiere wurden im Labortierzentrum der Ningxia Medical University aufgezogen. Die Temperatur und die Luftfeuchtigkeit waren angemessen, der Tag-Nacht-Lichtzyklus wurde beibehalten und das Essen und Wasser waren kostenlos und ausreichend.

1. Präoperative Vorbereitung

1. Vorbereitung der Materialien
   1. Bereiten Sie Rattenplatten, Inhalationsanästhesiegeräte, eingebettete Boxen, gefrorene Aufbewahrungsröhrchen, Einweg-OP-Handschuhe und -Masken, Weithalsflaschen, 4% Paraformaldehyd, Eisbeutel, Augenscheren, Augenpinzetten, chirurgische Klingen und Messergriffe, 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor und sterilisieren Sie sie im Voraus (siehe Materialtabelle).
2. Zubereitung von Tieren
   1. Teilen Sie 20 männliche SD-Ratten nach dem Zufallsprinzip in eine Modellgruppe (n=10) und eine Kontrollgruppe (n=10) ein. Modellratten werden intraperitoneal mit 60 mg/kg MNU injiziert und Kontrollratten intraperitoneal mit dem gleichen Volumen Kochsalzlösung injiziert.
   2. Nach 7 Tagen Injektion fasten Sie die Ratten und lassen Sie sie in der Nacht vor der Probenahme frei trinken.
   3. Legen Sie am nächsten Tag die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch und verwenden Sie eine Maske, um eine Anästhesie mit 4% Isofluran und 2 l/min Sauerstoff zu verabreichen. Messen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Mitte des Fußes zusammendrücken, um die Reaktionen der Ratten zu beobachten.

2. Netzhautprobenahme zum Nachweis von Proteinfaktoren

1. Fixieren Sie die Augenhöhle der Ratte mit der linken Hand und entfernen Sie das Auge mit mäßiger Kraft mit der rechten Hand mit einer ophthalmischen Biegezange. Lege den Augapfel in sagittaler Position in eine kalte Glasschale.
2. Mit der linken Hand, die eine gerade Pinzette hält, um den Augapfel zu fixieren, und der rechten Hand, die die chirurgische Klinge hält, machen Sie einen 2 mm langen Längsschnitt in der Nähe der Linsenstelle.
3. Schneiden Sie die Hornhaut mit der Augenschere entlang des Schnitts ab und ziehen Sie vorsichtig die Linse, den Glaskörper und die freiliegende Augenmuschel ab.
4. Platzieren Sie die Unterseite der Augenmuschel an der Spitze des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens, drehen Sie die Augenmuschel über das Röhrchen und legen Sie die Netzhaut frei (die Netzhaut ist schwach gelb).
5. Entfernen Sie die gesamte Netzhaut entlang der Sklerawand des Augapfels mit einer ophthalmischen Biegepinzette, legen Sie sie dann in ein gefrorenes Röhrchen und bewahren Sie sie für die zukünftige Verwendung in einem Flüssigstickstofftank auf (Abbildung 1).

3. Netzhautprobenahme zur pathologischen Untersuchung und spezifischen Zellfärbung

1. Hebe mit der linken Hand mit der Augenzange den Augenwinkel der Ratte an. Schneiden Sie mit der rechten Hand mit einer chirurgischen Klinge eine 4 mm breite Öffnung entlang des Augenwinkels der Ratte.
2. Klemmen Sie mit der Augenzange den Rand des Augapfels an der Öffnung in der linken Hand fest. Schneiden Sie mit einer Augenschere das umgebende Gewebe entlang des Randes des Augapfels ab, während Sie darauf achten, das umgebende Gewebe des Augapfels zu reinigen.
3. Trennen Sie das Gewebe um den Sehnerv am hinteren Pol des Augapfels mit einer Augenzange, schneiden Sie den Sehnerv ab und achten Sie darauf, ihn zu erhalten. Entfernen Sie dann den Augapfel.
4. Waschen Sie den entfernten Augapfel in Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen, rollen Sie ihn auf Filterpapier, um überschüssiges Wasser aufzunehmen, und legen Sie ihn auf kalte Alufolie.
5. Fixieren Sie das Auge mit einer Augenpinzette. Machen Sie mit einer chirurgischen Klinge einen 4 mm langen Längsschnitt entlang der Verbindung von Hornhaut und Netzhaut.
6. Entfernen Sie die Hornhaut mit einer Augenschere, machen Sie einen kreisförmigen Schnitt entlang des Schnitts und entfernen Sie vorsichtig die Linse und den Glaskörper.
7. Legen Sie die verbleibende Augenmuschel mit einem Sehnerv in eine Einbettbox und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd.
8. Paraformaldehyd-fixierte Proben in Paraffin einbetten und in 4-μm-Scheiben schneiden für die HE-Färbung und die TUNEL-Färbung⁷.

4. HE-Verfärbung der Netzhaut von Ratten

1. Entparaffinierung und Hydratation: Legen Sie die Scheiben 10 Minuten lang in Xylol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 10 Minuten, gefolgt von absolutem Ethanol für 5 Minuten, wiederholen Sie die Ethanolbehandlung für weitere 5 Minuten, gefolgt von einer Behandlung in 95 % Alkohol für 5 Minuten, dann in 85 % Alkohol für 5 Minuten und schließlich in 75 % Alkohol für 5 Minuten.
2. Hämatoxylin-Färbung: Spülen Sie die Scheibe 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser ab. Verwenden Sie 100 μl Hämatoxylin-Färbelösung und färben Sie sie 5 Minuten lang, spülen Sie sie 5-10 s lang mit deionisiertem Wasser ab. 100 μl 1%iges Salzsäure-Ethanol für 30 s zugeben, 20 min lang mit entionisiertem Wasser spülen und 100 μl 0,2 %iges Ammoniakwasser 1 min lang hinzufügen. 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser spülen.
3. Eosin-Färbung: Verwenden Sie 100 μl Eosin-Färbelösung, um 5 Minuten lang zu färben, und spülen Sie sie 30 s lang mit entionisiertem Wasser ab.
4. Dehydrierung und Versiegelung: Tauchen Sie die Scheiben 5 Minuten lang in 70 % Alkohol, dann 5 Minuten lang in 85 % Alkohol, gefolgt von 90 % Alkohol für 5 Minuten und absolutem Ethanol für 5 Minuten. Wiederholen Sie die Behandlung mit absolutem Ethanol für weitere 5 Minuten, tauchen Sie sie dann für 5 Minuten in Xylol und wiederholen Sie den Vorgang für weitere 5 Minuten. Zum Schluss versiegeln Sie, indem Sie ca. 100 μl neutrales Harz auf die Oberfläche der Scheiben geben und dann mit einem Deckglas abdecken.
5. Bildgebung der Objektträger: Positionieren Sie die gefärbten Schichten auf dem Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis das Bild deutlich sichtbar ist, stellen Sie die Vergrößerung auf 400x ein und nehmen Sie das Bild auf.
6. Messen Sie die Gesamtdicke der Netzhaut und die äußere Netzhautdicke: Messen Sie die Gesamtdicke der Netzhaut und die äußere Netzhautdicke (Dicke der äußeren Kernschicht und der Photorezeptorschicht) und berechnen Sie den Prozentsatz der äußeren Netzhautdicke
   Äußere Netzhautdicke (%) = (äußere Netzhautdicke/Gesamtdicke der Netzhaut) x 100.

5. Bestimmung der Apoptoserate von retinalen Photorezeptorzellen mit der TUNEL-Methode

1. Entparaffinierung und Hydratation: Legen Sie die Scheiben für 10 Minuten in Xylol, wiederholen Sie den Vorgang für weitere 10 Minuten, legen Sie sie dann für 5 Minuten in absolutes Ethanol und wiederholen Sie diesen Schritt für weitere 5 Minuten. Führen Sie eine Dehydrierung durch, indem Sie 5 Minuten lang 95 % Alkohol, 5 Minuten lang 90 % Alkohol, 5 Minuten lang 80 % Alkohol und 5 Minuten lang 70 % Alkohol einfüllen und 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser abspülen.
2. 5 min mit 0,85%iger Natriumchloridlösung und 5 min mit PBS spülen. Mit Paraformaldehyd unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd für 15 min fixieren. 5 Minuten lang mit PBS spülen und den Vorgang weitere 5 Minuten wiederholen.
3. Inkubation und Äquilibrierung⁷: 15 min lang mit 20 μg/ml Proteinase K-Lösung zum Aufschluss inkubieren, 10 min im Gleichgewichtspuffer äquilibrieren und 60 min mit rekombinantem terminalem Desoxynukleotidyltransferase (rTdT)-Puffer bei 37 °C inkubieren.
4. Stoppreaktion: 100 μL die Standard-Citratlösung (2x SSC-Lösung) für 15 min zugeben. 5 Minuten lang mit PBS spülen und den Vorgang weitere 5 Minuten wiederholen.
5. Kernfarbstoff: 100 μL 4 ′, 6-Diamidin-2-phenindl (DAPI) Reagenz für 5 min hinzufügen. Waschen Sie den Vorgang 5 Minuten lang mit entionisiertem Wasser und wiederholen Sie den Vorgang für weitere 5 Minuten.
6. Versiegeln: Wischen Sie überschüssiges Xylol um die Scheiben herum und versiegeln Sie, indem Sie ca. 100 μl neutrales Harz auf die Oberfläche der Scheiben geben und dann mit einem Deckglas abdecken.
7. Mikroskopie: Legen Sie die gefärbten Scheiben auf das Mikroskop, stellen Sie den Fokus des Mikroskops für eine klare Sicht ein, stellen Sie die Vergrößerung auf 400x ein und nehmen Sie das Bild auf. Beobachten Sie die grüne Fluoreszenz bei 520 ± 20 nm mit einem Standard-Fluoreszenzfilter. Beobachten Sie den blauen DAPI bei 460 nm.
8. Berechnen Sie die Apoptose-Rate: Messen Sie die grünen Fluoreszenzwerte und die blauen Fluoreszenzwerte der äußeren retinalen Kernschicht. Berechnen Sie die Apoptoserate als
   Apoptose-Zellrate = grüner Fluoreszenzwert/blauer Fluoreszenzwert x 100.

6. Western-Blot-Analyse ¹⁰

1. Behandlung mit Lysepuffer: Zerkleinern und homogenisieren Sie eine gefrorene Netzhaut mit 50 μl kaltem Lysepuffer (1 ml Lysepuffer mit 5 μl Phosphatase-Inhibitor, 1 μl Protease-Inhibitor und 5 μl 100 mM PMSF).
2. Unterliegt einer 28 kHz Beschallung für 5 s in einem Eisbad; 3x wiederholen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 10.000 x g , um Zelltrümmer zu entfernen. Bewahren Sie den Überstand auf.
3. em>6.3Quantifizierung des Proteins: Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Reagenzkit.
4. em>6.4Elektrophorese: 50 μg Proteinprobe laden und auf 12 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) abtrennen.
5. Übertragung auf Membran: Elektrophoretische Übertragung auf PVDF-Membranen mit einem elektrophoretischen Transfersystem.
6. Membranen unterteilen: Unterteilen Sie die Membranen und analysieren Sie jedes Protein von Interesse, β-Aktin und GAPDH aus einem einzigen Transfer.
7. Blockieren: Blockieren Sie die Membranen für 1 h in TBST mit 5 % fettfreier Milch bei Raumtemperatur.
8. Primärantikörper inkubieren: Mit dem Primärantikörper aus gespaltener Caspase-9 (1:200 Verdünnung), gespaltener Caspase-3 (1:200 Verdünnung), gespaltener Caspase-7 (1:200 Verdünnung) und β-Aktin (1:1000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C inkubieren. Die Membranen 5 min mit TBST waschen, 3x wiederholen.
9. Zweiten Antikörper inkubieren: Mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern (1:2000) 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Die Membranen 5 min mit TBST waschen, 3x wiederholen.
10. Belichtung: Visualisieren Sie die markierten Proteine mit Western-Blot-Substrat und belichten Sie schließlich die Membranen, um die Proteinbanden in einem automatischen Belichtungsmodus zu visualisieren.
11. Berechnen Sie den Proteingehalt⁷ , indem Sie die Proteinbandendichte messen.

7. Statistische Auswertung

1. Analysieren Sie die Daten mit der SPSS 19.0-Software und stellen Sie sie als Mittelwert ± Standardabweichung dar. Führen Sie statistische Analysen der beobachteten Werte mit einer unidirektionalen Varianzanalyse durch. Nehmen Sie p< 0,05 als statistisch signifikant an.

Ergebnisse

Nach der HE-Färbung wiesen alle Netzhautschichten von Ratten in der Kontrollgruppe eine klare Gewebestruktur, eine geordnete Zellanordnung und eine gleichmäßige Färbung auf, während die Netzhautstruktur der Ratten in der Modellgruppe signifikant geschädigt war, die äußere Netzhautschicht dünner war, die äußere Kernschicht fast vollständig mit der inneren Kernschicht integriert war, die Anordnung der Zellen in der Schicht extrem ungeordnet war, Die Anzahl der Zellschichten wu...

Diskussion

RP ist eine häufige Netzhauterkrankung in Kliniken. Der Beginn, der Schweregrad und das Fortschreiten der RP hängen mit Genen und genetischen Modi zusammen und werden von der Umwelt beeinflusst ^8,11. RP umfasst familiäre RP und gelegentliche RP, von denen familiäre RP etwa 60% der Patienten ausmacht. Durch die Rückverfolgung der genetischen Anamnese der Familie wurden bisher 83 Gene identifiziert, die mit RP in Verbindung st...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970