Amostragem de danos na retina de ratos induzidos por N-metil-N-nitrosoureia e avaliação multiíndice de alterações patológicas

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento para amostragem de retina em ratos e utilizando coloração de hematoxilina-eosina, ensaio TUNEL e Western blot para detectar alterações patológicas e apoptose na retina após injeção intraperitoneal de N-Metil-N-Nitrosourea.

Resumo

A retinopatia pode ser observada na maioria das doenças oculares e nas complicações tardias do diabetes mellitus. As células epiteliais pigmentares específicas e os danos e degeneração das células ópticas são as principais características da retinopatia. Muitos medicamentos tradicionais mostraram eficácia clínica substancial no tratamento da retinopatia. Como obter uma retina de forma rápida e completa é um passo fundamental na pesquisa da medicina tradicional para o tratamento da retinopatia. Neste estudo, pretendemos fornecer um procedimento padronizado e exercível para amostragem de danos na retina de ratos induzidos por N-metil-N-nitrosoureia (MNU) e avaliação multiíndice de alterações patológicas. Os ratos foram injetados por via intraperitoneal com 60 mg / kg de MNU uma vez para induzir danos à retina, e amostras de retina foram obtidas após 7 dias. Além disso, realizamos coloração de hematoxilina-eosina para avaliar alterações patológicas da retina. Determinação da taxa de apoptose e da proteína de apoptose por TUNEL e Western blot. Esses protocolos padronizados para amostragem de retina e avaliação de alterações patológicas são úteis para promover a exploração do mecanismo da retinopatia e a descoberta de ervas tradicionais novas e eficazes.

Introdução

A retinite pigmentosa (RP) é uma doença hereditária e cegante^{da retina 1}. A incidência de RP está entre 1/3500 e 1/5000, afetando a função visual de cerca de 2,5 milhões de pessoas no mundo. É uma das doenças mais conhecidas que levam à deficiência visual em seres humanos, impondo um fardo significativo a toda a sociedade². A doença é caracterizada pela perda gradual da função das células epiteliais pigmentares da retina e pela apoptose progressiva dos fotorreceptores. No estágio inicial, os pacientes experimentam cegueira noturna, que se manifesta como defeitos no campo visual periférico e, eventualmente, leva à perda da visão central³. Portanto, a inibição da apoptose dos fotorreceptores retinianos é o ponto de referência para a prevenção e tratamento do FR.

A apoptose das células da retina é uma característica comum do RP humano e de animais modelo⁴. A injeção intraperitoneal de 60 mg/kg de N-metil-N-nitrosoureia (MNU) em ratos por 7 dias pode induzir apoptose e perda de células fotorreceptoras da retina, sendo um modelo animal comumente usado de RP ^5,6. A análise das mudanças na estrutura patológica, apoptose celular específica e expressão proteica relacionada à apoptose do tecido retiniano em animais modelo pode fornecer dados experimentais eficazes e suporte teórico no estudo da patogênese do FR humano e drogas de triagem ^7,8. Portanto, a qualidade das amostras de retina determina a confiabilidade dos dados experimentais. No entanto, devido à particularidade do tecido ocular, existem poucos relatos sobre como obter a retina de rato⁹.

Este artigo fornece um procedimento simples, rápido, padronizado e operável para amostragem de retina em ratos para superar as deficiências acima. A coloração de hematoxilina-eosina (HE), a coloração terminal mediada por desoxinucleotidil transferase de desoxiuridina trifosfato-digoxigenina (TUNEL) e o Western blot são usados para analisar as alterações patológicas no dano tecidual da retina e apoptose nos ratos. Todos os métodos são derivados da experiência do nosso grupo de pesquisa com os processos operacionais específicos.

Protocolo

Todos os protocolos e procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Ningxia (número de ética: NO. 2020-Q066). Ratos machos SPF Sprauge-Dawley (SD), com idade entre 7 e 8 semanas e pesando 200-220 g, foram adquiridos da Ningxia Medical University com o número de licença animal SCXK (Ning) 2020-0001. Todos os animais foram criados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Ningxia. A temperatura e a umidade eram adequadas, o ciclo de luz dia-noite era mantido e a comida e a água eram gratuitas e suficientes.

1. Preparo pré-operatório

1. Preparação de materiais
   1. Prepare placas de ratos, dispositivos de anestesia inalatória, caixas embutidas, tubos de armazenamento congelados, luvas e máscaras cirúrgicas descartáveis, frascos de boca larga, paraformaldeído a 4%, compressas de gelo, tesouras oftálmicas, pinças oftálmicas, lâminas cirúrgicas e cabos de facas, tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e esterilize-os com antecedência (ver Tabela de Materiais).
2. Preparação animal
   1. Divida aleatoriamente 20 ratos SD machos em grupo modelo (n = 10) e grupo controle (n = 10). Injete 60 mg / kg de MNU em ratos modelo por via intraperitoneal e injete ratos controle por via intraperitoneal com o mesmo volume de solução salina.
   2. Após 7 dias de injeção, jejue os ratos e deixe-os beber livremente na noite anterior à amostragem.
   3. No dia seguinte, coloque o rato em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e use uma máscara para administrar anestesia com isoflurano a 4% e oxigênio 2 L/min. Meça a profundidade da anestesia beliscando o centro do pé para observar as reações dos ratos.

2. Amostragem de retina para detecção de fator de proteína

1. Fixe a órbita ocular do rato com a mão esquerda e remova o olho com força moderada com a mão direita usando uma pinça de flexão oftálmica. Coloque o globo ocular em uma posição sagital em um prato de vidro frio.
2. Com a mão esquerda segurando uma pinça reta oftálmica para fixar o globo ocular e a mão direita segurando a lâmina cirúrgica, faça uma incisão longitudinal de 2 mm perto do local da lente.
3. Corte a córnea com a tesoura oftálmica ao longo da incisão e retire suavemente a lente, o vítreo e a ocular exposta.
4. Coloque a parte inferior da ocular na ponta do tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, gire a ocular sobre o tubo e exponha a retina (a retina é amarela fraca).
5. Remova toda a retina ao longo da parede escleral do globo ocular com uma pinça oftálmica dobrável, coloque-a em um tubo congelado e armazene-a em um tanque de nitrogênio líquido para uso futuro (Figura 1).

3. Amostragem de retina para exame patológico e coloração celular específica

1. Com a mão esquerda, use a pinça para levantar o canto do olho do rato. Com a mão direita, use uma lâmina cirúrgica para cortar uma abertura de 4 mm ao longo do canto do olho do rato.
2. Use a pinça para prender a borda do globo ocular na abertura da mão esquerda. Use uma tesoura oftálmica para cortar os tecidos circundantes ao longo da borda do globo ocular, prestando atenção à limpeza dos tecidos circundantes do globo ocular.
3. Separe os tecidos ao redor do nervo óptico no pólo posterior do globo ocular com uma pinça, corte o nervo óptico e preste atenção para preservá-lo. Em seguida, remova o globo ocular.
4. Lave o globo ocular removido em solução salina para remover o sangue restante, enrole-o em papel de filtro para absorver o excesso de água e coloque-o em papel alumínio frio.
5. Fixe o olho com uma pinça oftálmica. Faça uma incisão longitudinal de 4 mm ao longo da junção da córnea e da retina com uma lâmina cirúrgica.
6. Remova a córnea com uma tesoura oftálmica, faça um corte circular ao longo da incisão e remova suavemente o cristalino e o corpo vítreo.
7. Coloque a ocular restante com um nervo óptico em uma caixa de incorporação e fixe-a em paraformaldeído a 4%.
8. Incorpore amostras fixadas em paraformaldeído em parafina e corte em fatias de 4 μm para coloração HE e coloração TUNEL⁷.

4. Coloração HE da retina de rato

1. Desparafinação e hidratação: Coloque as fatias em xileno por 10 min, repita o processo por mais 10 min, seguido de etanol absoluto por 5 min, repita o tratamento com etanol por mais 5 min, seguido de tratamento em álcool 95% por 5 min, depois em álcool 85% por 5 min e, finalmente, em álcool 75% por 5 min.
2. Coloração de hematoxilina: Enxágue a fatia com água deionizada por 5 min. Use 100 μL de solução de coloração de hematoxilina e core por 5 min, enxágue com água deionizada por 5-10 s. Adicione 100 μL de etanol de ácido clorídrico a 1% por 30 s, enxágue com água deionizada por 20 min e adicione 100 μL de água com amônia a 0,2% por 1 min. Enxágüe com água deionizada por 5 min.
3. Coloração de eosina: Use 100 μL de solução de coloração de eosina para corar por 5 min e enxágue com água deionizada por 30 s.
4. Desidratação e vedação: Mergulhe as fatias em álcool 70% por 5 min, depois álcool 85% por 5 min, seguido de álcool 90% por 5 min e etanol absoluto por 5 min. Repita o tratamento com etanol absoluto por mais 5 min, depois mergulhe em xileno por 5 min e repita o processo por mais 5 min. Por fim, sele adicionando aproximadamente 100 μL de resina neutra à superfície das fatias e, em seguida, cubra-a com uma lamínula.
5. Imagem das lâminas: Posicione as fatias coradas no microscópio, ajuste o foco do microscópio até que a imagem fique claramente visível, defina a ampliação em 400x e capture a imagem.
6. Meça a espessura total da retina e a espessura externa da retina: Meça a espessura total da retina e a espessura externa da retina (espessura da camada nuclear externa e da camada fotorreceptora) e calcule a porcentagem de espessura externa da retina
   Espessura externa da retina (%) = (espessura externa da retina/espessura total da retina) x 100.

5. Determinação da taxa de apoptose de células fotorreceptoras da retina com o método TUNEL

1. Desparafinação e hidratação: Coloque as fatias em xileno por 10 min, repita o processo por mais 10 min, depois coloque em etanol absoluto por 5 min e repita esta etapa por mais 5 min. Realize a desidratação colocando álcool 95% por 5 min, álcool 90% por 5 min, álcool 80% por 5 min, álcool 70% por 5 min e enxágue com água deionizada por 5 min.
2. Enxágüe com solução de cloreto de sódio a 0,85% por 5 min e PBS por 5 min. Fixe com paraformaldeído usando paraformaldeído a 4% por 15 min. Enxágue com PBS por 5 min e repita o processo por mais 5 min.
3. Incubação e equilíbrio⁷: Incubar com solução de proteinase K 20 μg/mL para digestão por 15 min, equilibrar no tampão de equilíbrio por 10 min e incubar com tampão desoxinucleotidiltransferase terminal recombinante (rTdT) a 37 °C por 60 min.
4. Reação de parada: Adicione 100 μL da solução padrão de citrato (2x solução SSC) por 15 min. Enxágue com PBS por 5 min e repita o processo por mais 5 min.
5. Corante nuclear: Adicione 100 μL 4 ′, reagente 6-diamidina-2-fenindl (DAPI) por 5 min. Lave com água deionizada por 5 min e repita o processo por mais 5 min.
6. Selar: Limpe o excesso de xileno ao redor das fatias e sele adicionando aproximadamente 100 μL de resina neutra à superfície das fatias e, em seguida, cubra-a com uma lamínula.
7. Microscopia: Coloque as fatias coradas no microscópio, ajuste o foco do microscópio para uma visibilidade clara, defina a ampliação para 400x e capture a imagem. Observar a fluorescência verde a 520 ± 20 nm utilizando um filtro de fluorescência normalizado. Observe o DAPI azul a 460 nm.
8. Calcule a taxa de apoptose: meça os valores de fluorescência verde e azul da camada externa do núcleo da retina. Calcule a taxa de apoptose como
   Taxa de células de apoptose = valor de fluorescência verde/valor de fluorescência azul x 100.

6. Análise de Western blot ¹⁰

1. Tratamento com tampão de lise: Pique e homogeneize uma retina congelada com 50 μL de tampão de lise fria (1 mL de tampão de lise contendo 5 μL de inibidor de fosfatase, 1 μL de inibidor de protease e 5 μL de 100 mM de PMSF).
2. Sujeito a uma sonicação de 28 kHz por 5 s em banho de gelo; repita 3x. Centrifugue a 4 °C por 5 min a 10.000 x g para remover detritos celulares. Mantenha o sobrenadante.
3. em>6.3Quantificação da proteína: Determinar a concentração de proteína utilizando um kit de reagentes para ensaio de proteína BCA.
4. em>6.4Eletroforese: Carregar 50 μg de amostra de proteína e separar em eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio a 12% (SDS-PAGE).
5. Transferência para a membrana: Transferência eletroforeticamente para membranas de PVDF usando um sistema de transferência eletroforética.
6. Subdivida as membranas: Subdivida as membranas e analise cada proteína de interesse, β-actina e GAPDH a partir de uma única transferência.
7. Bloqueio: Bloqueie as membranas por 1 h em TBST contendo 5% de leite desnatado à temperatura ambiente.
8. Incubar anticorpo primário: Incubar com anticorpo primário de caspase-9 clivada (diluição 1:200), caspase-3 clivada (diluição 1:200), caspase-7 clivada (diluição 1:200) e β-actina (diluição 1:1000) durante a noite a 4 °C. Lave as membranas com TBST por 5 min, repita 3x.
9. Incubar segundo anticorpo: Incubar com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (1:2000) por 2 h à temperatura ambiente. Lave as membranas com TBST por 5 min, repita 3x.
10. Exposição: Visualize as proteínas marcadas usando substrato de Western blot e, finalmente, exponha as membranas para visualizar as bandas de proteínas em um modo de exposição automática.
11. Calcular o teor de proteínas⁷ medindo a densidade da banda de proteínas.

7. Análise estatística

1. Analisar os dados utilizando o software SPSS 19.0 e apresentá-los como média ± desvio padrão. Realize análises estatísticas dos valores observados usando a análise de variância unidirecional. Tome p< 0,05 como estatisticamente significativo.

Resultados

Após a coloração HE, todas as camadas retinianas de ratos no grupo de controle tinham estrutura de tecido clara, arranjo celular ordenado e coloração uniforme, enquanto a estrutura retiniana de ratos no grupo modelo foi significativamente danificada, a camada retiniana externa era mais fina, a camada nuclear externa estava quase completamente integrada com a camada central interna, o arranjo das células na camada era extremamente desordenado, O número de camadas celulares foi sig...

Discussão

A RP é uma doença retiniana comum nas clínicas. O início, a gravidade e a progressão do FRy estão relacionados a genes e modos genéticos e são afetados pelo ambiente ^8,11. A FR inclui FR familiar e FR ocasional, das quais a FR familiar é responsável por cerca de 60% dos pacientes. Por meio do rastreamento da história genética familiar, 83 genes relacionados ao RP foram identificados até o momento, enquanto o RP ocasi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amersham Imager	GE	680
Ammonium persulfate	Boster Biological Technology Co.,Ltd	A8090
Analytical Balance	Mettler Toledo	ME104E
BCA protein quantization kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP902
cleaved caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	#9664
cleaved caspase-7 antibody	Cell Signaling Technology	#8438
cleaved caspase-9 antibody	Cell Signaling Technology	#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL System	Promega	G3250
Glycine	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)	Bioss Antibodies	bs-80295G-HRP
Goat serum	Biosharp	BL210A
High speed  crusher	Thermo Fisher Scientific	AG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranes	Merck Millipore. Ltd	ISEQ00010
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Methanol	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	20230108
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	1510
Microscope	Olympus	IX73
Microscope slide	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra	BIO-RAD	1658001
N-Methyl-N-Nitrosourea	sigma-Aldrich	N4766–100G
Oven	Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd	DHG-8145
Page Pre-solution (30% )	Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd	L3202A
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26617
PBS buffer	Biosharp	G4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)	Beyotime Biotechnology	P0015
Skim milk powder	BioFroxx	1172GR500
Sprague Dawley rats	Ningxia Medical University	SCXK (Ning) 2020-0001
TEMED	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1165
Total protein extraction kit	Ken Gen Biotech. Co. Ltd	KGP2100
Trans-Blot Module	BIO-RAD	1703935
Tris base	Boster Biological Technology Co.,Ltd	AR1162
Tweezer	Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd	130302027
β-actin	Cell Signaling Technology	#4970