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Method Article
Este protocolo descreve um procedimento para amostragem de retina em ratos e utilizando coloração de hematoxilina-eosina, ensaio TUNEL e Western blot para detectar alterações patológicas e apoptose na retina após injeção intraperitoneal de N-Metil-N-Nitrosourea.
A retinopatia pode ser observada na maioria das doenças oculares e nas complicações tardias do diabetes mellitus. As células epiteliais pigmentares específicas e os danos e degeneração das células ópticas são as principais características da retinopatia. Muitos medicamentos tradicionais mostraram eficácia clínica substancial no tratamento da retinopatia. Como obter uma retina de forma rápida e completa é um passo fundamental na pesquisa da medicina tradicional para o tratamento da retinopatia. Neste estudo, pretendemos fornecer um procedimento padronizado e exercível para amostragem de danos na retina de ratos induzidos por N-metil-N-nitrosoureia (MNU) e avaliação multiíndice de alterações patológicas. Os ratos foram injetados por via intraperitoneal com 60 mg / kg de MNU uma vez para induzir danos à retina, e amostras de retina foram obtidas após 7 dias. Além disso, realizamos coloração de hematoxilina-eosina para avaliar alterações patológicas da retina. Determinação da taxa de apoptose e da proteína de apoptose por TUNEL e Western blot. Esses protocolos padronizados para amostragem de retina e avaliação de alterações patológicas são úteis para promover a exploração do mecanismo da retinopatia e a descoberta de ervas tradicionais novas e eficazes.
A retinite pigmentosa (RP) é uma doença hereditária e ceganteda retina 1. A incidência de RP está entre 1/3500 e 1/5000, afetando a função visual de cerca de 2,5 milhões de pessoas no mundo. É uma das doenças mais conhecidas que levam à deficiência visual em seres humanos, impondo um fardo significativo a toda a sociedade2. A doença é caracterizada pela perda gradual da função das células epiteliais pigmentares da retina e pela apoptose progressiva dos fotorreceptores. No estágio inicial, os pacientes experimentam cegueira noturna, que se manifesta como defeitos no campo visual periférico e, eventualmente, leva à perda da visão central3. Portanto, a inibição da apoptose dos fotorreceptores retinianos é o ponto de referência para a prevenção e tratamento do FR.
A apoptose das células da retina é uma característica comum do RP humano e de animais modelo4. A injeção intraperitoneal de 60 mg/kg de N-metil-N-nitrosoureia (MNU) em ratos por 7 dias pode induzir apoptose e perda de células fotorreceptoras da retina, sendo um modelo animal comumente usado de RP 5,6. A análise das mudanças na estrutura patológica, apoptose celular específica e expressão proteica relacionada à apoptose do tecido retiniano em animais modelo pode fornecer dados experimentais eficazes e suporte teórico no estudo da patogênese do FR humano e drogas de triagem 7,8. Portanto, a qualidade das amostras de retina determina a confiabilidade dos dados experimentais. No entanto, devido à particularidade do tecido ocular, existem poucos relatos sobre como obter a retina de rato9.
Este artigo fornece um procedimento simples, rápido, padronizado e operável para amostragem de retina em ratos para superar as deficiências acima. A coloração de hematoxilina-eosina (HE), a coloração terminal mediada por desoxinucleotidil transferase de desoxiuridina trifosfato-digoxigenina (TUNEL) e o Western blot são usados para analisar as alterações patológicas no dano tecidual da retina e apoptose nos ratos. Todos os métodos são derivados da experiência do nosso grupo de pesquisa com os processos operacionais específicos.
Todos os protocolos e procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica de Ningxia (número de ética: NO. 2020-Q066). Ratos machos SPF Sprauge-Dawley (SD), com idade entre 7 e 8 semanas e pesando 200-220 g, foram adquiridos da Ningxia Medical University com o número de licença animal SCXK (Ning) 2020-0001. Todos os animais foram criados no Centro de Animais de Laboratório da Universidade Médica de Ningxia. A temperatura e a umidade eram adequadas, o ciclo de luz dia-noite era mantido e a comida e a água eram gratuitas e suficientes.
1. Preparo pré-operatório
2. Amostragem de retina para detecção de fator de proteína
3. Amostragem de retina para exame patológico e coloração celular específica
4. Coloração HE da retina de rato
5. Determinação da taxa de apoptose de células fotorreceptoras da retina com o método TUNEL
6. Análise de Western blot 10
7. Análise estatística
Após a coloração HE, todas as camadas retinianas de ratos no grupo de controle tinham estrutura de tecido clara, arranjo celular ordenado e coloração uniforme, enquanto a estrutura retiniana de ratos no grupo modelo foi significativamente danificada, a camada retiniana externa era mais fina, a camada nuclear externa estava quase completamente integrada com a camada central interna, o arranjo das células na camada era extremamente desordenado, O número de camadas celulares foi sig...
A RP é uma doença retiniana comum nas clínicas. O início, a gravidade e a progressão do FRy estão relacionados a genes e modos genéticos e são afetados pelo ambiente 8,11. A FR inclui FR familiar e FR ocasional, das quais a FR familiar é responsável por cerca de 60% dos pacientes. Por meio do rastreamento da história genética familiar, 83 genes relacionados ao RP foram identificados até o momento, enquanto o RP ocasi...
Os autores não têm nada a divulgar.
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Pesquisa Científica do Departamento de Ensino Superior de Ningxia (NYG2022029).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Imager | GE | 680 | |
Ammonium persulfate | Boster Biological Technology Co.,Ltd | A8090 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | ME104E | |
BCA protein quantization kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP902 | |
cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | #9664 | |
cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | #8438 | |
cleaved caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | #9507 | |
DeadEnd Fluorometric TUNEL System | Promega | G3250 | |
Glycine | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1200 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Bioss Antibodies | bs-80295G-HRP | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
High speed crusher | Thermo Fisher Scientific | AG22331 | |
Immobilon-P SQ Transfer membranes | Merck Millipore. Ltd | ISEQ00010 | |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22-10 | |
Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific | 1510 | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
Mini-PROTEAN Tetra | BIO-RAD | 1658001 | |
N-Methyl-N-Nitrosourea | sigma-Aldrich | N4766–100G | |
Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
Page Pre-solution (30% ) | Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd | L3202A | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26617 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×) | Beyotime Biotechnology | P0015 | |
Skim milk powder | BioFroxx | 1172GR500 | |
Sprague Dawley rats | Ningxia Medical University | SCXK (Ning) 2020-0001 | |
TEMED | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1165 | |
Total protein extraction kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP2100 | |
Trans-Blot Module | BIO-RAD | 1703935 | |
Tris base | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1162 | |
Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 |
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