A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימת רשתית של חולדות ושימוש בצביעה של המטוקסילין-אאוזין, בדיקת TUNEL וכתם מערבי לאיתור שינויים פתולוגיים ואפופטוזיס ברשתית לאחר הזרקה תוך-צפקית של N-Methyl-N-Nitrosourea.
ניתן להבחין ברטינופתיה ברוב מחלות העיניים ובסיבוכים המאוחרים של סוכרת. תאי האפיתל הפיגמנט הספציפיים והנזק והניוון של תאי הראייה הם המאפיינים העיקריים של רטינופתיה. תרופות מסורתיות רבות הראו יעילות קלינית משמעותית בטיפול ברטינופתיה. כיצד להשיג רשתית במהירות ובשלמות הוא שלב מפתח במחקר הרפואה המסורתית לטיפול ברטינופתיה. במחקר זה, אנו שואפים לספק הליך סטנדרטי וניתן להפעלה לדגימה של נזק לרשתית של חולדות המושרה על ידי N-methyl-N-nitrosourea (MNU) והערכה מרובת אינדקסים של שינויים פתולוגיים. לחולדות הוזרקו 60 מ"ג/ק"ג MNU תוך צפקי פעם אחת כדי לגרום נזק לרשתית, ודגימות רשתית התקבלו לאחר 7 ימים. בנוסף, ביצענו צביעת המטוקסילין-אאוזין כדי להעריך שינויים פתולוגיים ברשתית. קביעת שיעור האפופטוזיס וחלבון האפופטוזיס על ידי TUNEL וכתם מערבי. פרוטוקולים מתוקננים אלה לדגימת רשתית ולהערכת שינויים פתולוגיים מסייעים בקידום חקר מנגנון הרטינופתיה וגילוי צמחי מרפא מסורתיים חדשים ויעילים.
רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) היא מחלת רשתית תורשתית ומסנוורת1. שכיחות RP היא בין 1/3500 ל-1/5000, ומשפיעה על תפקוד הראייה של כ-2.5 מיליון אנשים בעולם. זוהי אחת המחלות הידועות ביותר המובילות ללקות ראייה בבני אדם, ומטילה נטל משמעותי על החברה כולה2. המחלה מאופיינת באובדן הדרגתי של תפקוד תאי האפיתל של פיגמנט הרשתית ואפופטוזיס מתקדם של קולטני האור. בשלב המוקדם, החולים חווים עיוורון לילה, המתבטא בפגמים בשדה הראייה ההיקפי ומוביל בסופו של דבר לאובדן הראייה המרכזית3. לכן, עיכוב אפופטוזיס של קולטני אור ברשתית הוא נקודת הציון למניעה וטיפול ב- RP.
אפופטוזיס של תאי רשתית הוא מאפיין נפוץ של RP אנושי וחיות מודל4. הזרקה תוך-צפקית של 60 מ"ג/ק"ג N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) בחולדות למשך 7 ימים עלולה לגרום לאפופטוזיס ולאובדן תאי קולטני אור ברשתית, וזהו מודל בעלי חיים נפוץ של RP 5,6. ניתוח השינויים במבנה הפתולוגי, אפופטוזיס תאים ספציפיים וביטוי חלבון הקשור לאפופטוזיס של רקמת הרשתית בחיות מודל יכול לספק נתונים ניסיוניים יעילים ותמיכה תיאורטית בחקר הפתוגנזה של RP אנושי ותרופות סקר 7,8. לכן, איכות דגימות הרשתית קובעת את מהימנות הנתונים הניסיוניים. עם זאת, בשל הייחודיות של רקמת העין, ישנם מעט מאוד דיווחים כיצד להשיג את רשתית החולדה9.
מאמר זה מספק הליך פשוט, מהיר, סטנדרטי וניתן להפעלה לדגימת רשתית בחולדות כדי להתגבר על החסרונות לעיל. צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE), צביעת דאוקסיורידין טריפוספט-דיגוקסיגנין (TUNEL) בתיווך דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז (TUNEL), וכתם מערבי משמשים לניתוח השינויים הפתולוגיים בנזק לרקמת הרשתית ואפופטוזיס בחולדות. כל השיטות נגזרות מהניסיון של קבוצת המחקר שלנו עם התהליכים המבצעיים הספציפיים.
כל הפרוטוקולים וההליכים הכירורגיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה (מספר אתיקה: NO. 2020-Q066). חולדות זכרות SPF Sprauge-Dawley (SD), בגילאי 7-8 שבועות ובמשקל 200-220 גרם, נרכשו מהאוניברסיטה הרפואית נינגשיה עם מספר רישיון בעל חיים SCXK (Ning) 2020-0001. כל החיות גודלו במרכז חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית נינגשיה. הטמפרטורה והלחות היו מתאימות, מחזור האור יום-לילה נשמר, והמזון והמים היו בחינם ומספיקים.
1. הכנה טרום ניתוחית
2. דגימת רשתית לזיהוי גורם חלבון
3. דגימת רשתית לבדיקה פתולוגית וצביעה ספציפית של תאים
4. HE מכתים של רשתית חולדה
5. קביעת קצב האפופטוזיס של תאי קולטני אור ברשתית בשיטת TUNEL
6. ניתוח כתמים מערביים 10
7. ניתוח סטטיסטי
לאחר צביעת HE, לכל שכבות הרשתית של החולדות בקבוצת הביקורת היה מבנה רקמה ברור, סידור תאים מסודר וצביעה אחידה, בעוד שמבנה הרשתית של חולדות בקבוצת המודל נפגע משמעותית, שכבת הרשתית החיצונית הייתה דקה יותר, השכבה הגרעינית החיצונית השתלבה כמעט לחלוטין עם שכבת הליבה הפנימית, סיד...
RP היא מחלת רשתית שכיחה במרפאות. ההופעה, החומרה וההתקדמות של RP קשורים לגנים ולמצבים גנטיים ומושפעים מהסביבה 8,11. RP כולל RP משפחתי ו-RP מזדמן, מתוכם RP משפחתי מהווה כ-60% מהמטופלים. באמצעות מעקב אחר ההיסטוריה הגנטית המשפחתית, זוהו עד כה 83 גנים הקשו?...
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר המדעי של המחלקה להשכלה גבוהה של נינגשיה (NYG2022029).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Imager | GE | 680 | |
Ammonium persulfate | Boster Biological Technology Co.,Ltd | A8090 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | ME104E | |
BCA protein quantization kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP902 | |
cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | #9664 | |
cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | #8438 | |
cleaved caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | #9507 | |
DeadEnd Fluorometric TUNEL System | Promega | G3250 | |
Glycine | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1200 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Bioss Antibodies | bs-80295G-HRP | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
High speed crusher | Thermo Fisher Scientific | AG22331 | |
Immobilon-P SQ Transfer membranes | Merck Millipore. Ltd | ISEQ00010 | |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22-10 | |
Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific | 1510 | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
Mini-PROTEAN Tetra | BIO-RAD | 1658001 | |
N-Methyl-N-Nitrosourea | sigma-Aldrich | N4766–100G | |
Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
Page Pre-solution (30% ) | Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd | L3202A | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26617 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×) | Beyotime Biotechnology | P0015 | |
Skim milk powder | BioFroxx | 1172GR500 | |
Sprague Dawley rats | Ningxia Medical University | SCXK (Ning) 2020-0001 | |
TEMED | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1165 | |
Total protein extraction kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP2100 | |
Trans-Blot Module | BIO-RAD | 1703935 | |
Tris base | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1162 | |
Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved