Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Этот протокол описывает процедуру забора образцов сетчатки крыс с использованием окрашивания гематоксилин-эозином, анализа TUNEL и вестерн-блоттинга для обнаружения патологических изменений и апоптоза в сетчатке после внутрибрюшинного введения N-метил-N-нитрозурии.
Ретинопатия может наблюдаться при большинстве глазных заболеваний и поздних осложнениях сахарного диабета. Специфические клетки пигментного эпителия, а также повреждение и дегенерация зрительных клеток являются основными признаками ретинопатии. Многие традиционные лекарственные средства показали значительную клиническую эффективность в лечении ретинопатии. Как быстро и полностью получить сетчатку глаза является ключевым этапом в исследованиях традиционной медицины для лечения ретинопатии. В этом исследовании мы стремимся предоставить стандартизированную и осуществимую процедуру отбора проб N-метил-N-нитрозомочевины (MNU), вызванного повреждением сетчатки крысы, и многоиндексной оценкой патологических изменений. Крысам вводили внутрибрюшинно 60 мг/кг MNU однократно, чтобы вызвать повреждение сетчатки, а образцы сетчатки были получены через 7 дней. Кроме того, мы проводили окрашивание гематоксилин-эозином для оценки патологических изменений сетчатки. Определение скорости апоптоза и белка апоптоза с помощью TUNEL и вестерн-блоттинга. Эти стандартизированные протоколы забора образцов сетчатки и оценки патологических изменений полезны для содействия изучению механизма ретинопатии и открытию новых и эффективных традиционных трав.
Пигментный ретинит (РП) является наследственным заболеванием сетчатки, приводящим к слепоте1. Частота возникновения РП составляет от 1/3500 до 1/5000, влияя на зрительную функцию около 2,5 миллионов человек в мире. Это одно из наиболее известных заболеваний, приводящее к ухудшению зрения у людей, налагающее значительное бремя на все общество2. Заболевание характеризуется постепенной потерей функции пигментных эпителиальных клеток сетчатки и прогрессирующим апоптозом фоторецепторов. На ранних стадиях у пациентов возникает куриная слепота, которая проявляется в виде дефектов периферического поля зрения и в конечном итоге приводит к потерецентрального зрения3. Таким образом, ингибирование апоптоза фоторецепторов сетчатки является ключевым направлением профилактики и лечения РП.
Апоптоз клеток сетчатки является общим признаком РП человека и модельных животных4. Внутрибрюшинное введение N-метил-N-нитрозомочевины (MNU) в дозу 60 мг/кг крысам в течение 7 дней может вызвать апоптоз и потерю фоторецепторных клеток сетчатки, и это широко используемая животная модель RP 5,6. Анализ изменений патологической структуры, специфического клеточного апоптоза и связанной с апоптозом экспрессии белка ткани сетчатки у модельных животных может обеспечить эффективные экспериментальные данные и теоретическую поддержку в изучении патогенеза РП человека и скрининговых препаратах 7,8. Таким образом, качество образцов сетчатки определяет достоверность экспериментальных данных. Однако, из-за особенностей глазной ткани, существует очень мало сообщений о том, как получить сетчатку глаза крысы9.
В этой статье представлена простая, быстрая, стандартизированная и работоспособная процедура забора образцов сетчатки у крыс для преодоления вышеуказанных недостатков. Для анализа патологических изменений в повреждении тканей сетчатки и апоптозе у крыс используются окрашивание гематоксилин-эозином (HE), опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой дезоксиуридинтрифосфат-дигоксигенин ник-энд (TUNEL) и вестерн-блоттинг. Все методы основаны на опыте нашей исследовательской группы в конкретных операционных процессах.
Все протоколы и хирургические процедуры были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Нинся (номер этики: No 2020-Q066). Самцы крыс SPF Sprauge-Dawley (SD) в возрасте 7-8 недель и весом 200-220 г были приобретены в Медицинском университете Нинся с номером лицензии на животное SCXK (Ning) 2020-0001. Все животные были выращены в Центре лабораторных животных Медицинского университета Нинся. Температура и влажность были подходящими, световой цикл дня и ночи сохранялся, а пища и вода были бесплатными и достаточными.
1. Предоперационная подготовка
2. Забор проб сетчатки для определения белкового фактора
3. Забор сетчатки для патологоанатомического исследования и специфического окрашивания клеток
4. HE-окрашивание сетчатки глаза крысы
5. Определение скорости апоптоза фоторецепторных клеток сетчатки методом TUNEL
6. Вестерн-блоттинг 10
7. Статистический анализ
После окрашивания HE все слои сетчатки крыс контрольной группы имели четкую тканевую структуру, упорядоченное расположение клеток и равномерное окрашивание, при этом структура сетчатки крыс модельной группы была значительно повреждена, наружный слой сетчатки оказа?...
РП является распространенным заболеванием сетчатки в клиниках. Начало, тяжесть и прогрессирование РП связаны с генами и генетическими модусами и зависят от окружающей среды 8,11. РП включает семейный РП и эпизодический РП, из которых сем...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Научно-исследовательским проектом Департамента высшего образования города Нинся (NYG2022029).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amersham Imager | GE | 680 | |
Ammonium persulfate | Boster Biological Technology Co.,Ltd | A8090 | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | ME104E | |
BCA protein quantization kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP902 | |
cleaved caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | #9664 | |
cleaved caspase-7 antibody | Cell Signaling Technology | #8438 | |
cleaved caspase-9 antibody | Cell Signaling Technology | #9507 | |
DeadEnd Fluorometric TUNEL System | Promega | G3250 | |
Glycine | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1200 | |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Bioss Antibodies | bs-80295G-HRP | |
Goat serum | Biosharp | BL210A | |
High speed crusher | Thermo Fisher Scientific | AG22331 | |
Immobilon-P SQ Transfer membranes | Merck Millipore. Ltd | ISEQ00010 | |
Isoflurane | RWD Life Science | R510-22-10 | |
Methanol | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 20230108 | |
Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific | 1510 | |
Microscope | Olympus | IX73 | |
Microscope slide | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 7105P-G | |
Mini-PROTEAN Tetra | BIO-RAD | 1658001 | |
N-Methyl-N-Nitrosourea | sigma-Aldrich | N4766–100G | |
Oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | DHG-8145 | |
Page Pre-solution (30% ) | Doublehelix Biology Science and Technology Co.,Ltd | L3202A | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26617 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×) | Beyotime Biotechnology | P0015 | |
Skim milk powder | BioFroxx | 1172GR500 | |
Sprague Dawley rats | Ningxia Medical University | SCXK (Ning) 2020-0001 | |
TEMED | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1165 | |
Total protein extraction kit | Ken Gen Biotech. Co. Ltd | KGP2100 | |
Trans-Blot Module | BIO-RAD | 1703935 | |
Tris base | Boster Biological Technology Co.,Ltd | AR1162 | |
Tweezer | Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd | 130302027 | |
β-actin | Cell Signaling Technology | #4970 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены