JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает процедуру забора образцов сетчатки крыс с использованием окрашивания гематоксилин-эозином, анализа TUNEL и вестерн-блоттинга для обнаружения патологических изменений и апоптоза в сетчатке после внутрибрюшинного введения N-метил-N-нитрозурии.

Аннотация

Ретинопатия может наблюдаться при большинстве глазных заболеваний и поздних осложнениях сахарного диабета. Специфические клетки пигментного эпителия, а также повреждение и дегенерация зрительных клеток являются основными признаками ретинопатии. Многие традиционные лекарственные средства показали значительную клиническую эффективность в лечении ретинопатии. Как быстро и полностью получить сетчатку глаза является ключевым этапом в исследованиях традиционной медицины для лечения ретинопатии. В этом исследовании мы стремимся предоставить стандартизированную и осуществимую процедуру отбора проб N-метил-N-нитрозомочевины (MNU), вызванного повреждением сетчатки крысы, и многоиндексной оценкой патологических изменений. Крысам вводили внутрибрюшинно 60 мг/кг MNU однократно, чтобы вызвать повреждение сетчатки, а образцы сетчатки были получены через 7 дней. Кроме того, мы проводили окрашивание гематоксилин-эозином для оценки патологических изменений сетчатки. Определение скорости апоптоза и белка апоптоза с помощью TUNEL и вестерн-блоттинга. Эти стандартизированные протоколы забора образцов сетчатки и оценки патологических изменений полезны для содействия изучению механизма ретинопатии и открытию новых и эффективных традиционных трав.

Введение

Пигментный ретинит (РП) является наследственным заболеванием сетчатки, приводящим к слепоте1. Частота возникновения РП составляет от 1/3500 до 1/5000, влияя на зрительную функцию около 2,5 миллионов человек в мире. Это одно из наиболее известных заболеваний, приводящее к ухудшению зрения у людей, налагающее значительное бремя на все общество2. Заболевание характеризуется постепенной потерей функции пигментных эпителиальных клеток сетчатки и прогрессирующим апоптозом фоторецепторов. На ранних стадиях у пациентов возникает куриная слепота, которая проявляется в виде дефектов периферического поля зрения и в конечном итоге приводит к потерецентрального зрения3. Таким образом, ингибирование апоптоза фоторецепторов сетчатки является ключевым направлением профилактики и лечения РП.

Апоптоз клеток сетчатки является общим признаком РП человека и модельных животных4. Внутрибрюшинное введение N-метил-N-нитрозомочевины (MNU) в дозу 60 мг/кг крысам в течение 7 дней может вызвать апоптоз и потерю фоторецепторных клеток сетчатки, и это широко используемая животная модель RP 5,6. Анализ изменений патологической структуры, специфического клеточного апоптоза и связанной с апоптозом экспрессии белка ткани сетчатки у модельных животных может обеспечить эффективные экспериментальные данные и теоретическую поддержку в изучении патогенеза РП человека и скрининговых препаратах 7,8. Таким образом, качество образцов сетчатки определяет достоверность экспериментальных данных. Однако, из-за особенностей глазной ткани, существует очень мало сообщений о том, как получить сетчатку глаза крысы9.

В этой статье представлена простая, быстрая, стандартизированная и работоспособная процедура забора образцов сетчатки у крыс для преодоления вышеуказанных недостатков. Для анализа патологических изменений в повреждении тканей сетчатки и апоптозе у крыс используются окрашивание гематоксилин-эозином (HE), опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой дезоксиуридинтрифосфат-дигоксигенин ник-энд (TUNEL) и вестерн-блоттинг. Все методы основаны на опыте нашей исследовательской группы в конкретных операционных процессах.

протокол

Все протоколы и хирургические процедуры были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Нинся (номер этики: No 2020-Q066). Самцы крыс SPF Sprauge-Dawley (SD) в возрасте 7-8 недель и весом 200-220 г были приобретены в Медицинском университете Нинся с номером лицензии на животное SCXK (Ning) 2020-0001. Все животные были выращены в Центре лабораторных животных Медицинского университета Нинся. Температура и влажность были подходящими, световой цикл дня и ночи сохранялся, а пища и вода были бесплатными и достаточными.

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовка материалов
    1. Подготовьте крысиные пластины, аппараты для ингаляционной анестезии, встроенные коробки, замороженные пробирки для хранения, одноразовые хирургические перчатки и маски, бутылочки с широким горлышком, 4% параформальдегид, пакеты со льдом, офтальмологические ножницы, офтальмотерапевтический пинцет, хирургические лезвия и рукоятки ножей, микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и заранее простилизуйте их (см. Таблицу материалов).
  2. Подготовка животных
    1. Случайным образом разделите 20 самцов SD крыс на модельную группу (n=10) и контрольную группу (n=10). Модельным крысам внутрибрюшинно вводят 60 мг/кг MNU, а контрольным крысам внутрибрюшинно вводят тот же объем физиологического раствора.
    2. После 7 дней инъекции кормите крыс голоданием и дайте им свободно пить в ночь перед взятием образца.
    3. На следующий день положите крысу лежа на операционный стол и используйте маску для введения анестезии с использованием 4% изофлурана и 2 л/мин кислорода. Измерьте глубину анестезии, сжав центр стопы, чтобы наблюдать за реакцией крыс.

2. Забор проб сетчатки для определения белкового фактора

  1. Зафиксируйте глазницу крысы левой рукой и удалите глаз с умеренной силой правой рукой с помощью офтальмологических изгибающих щипцов. Поместите глазное яблоко в сагиттальное положение в холодную стеклянную посуду.
  2. Левой рукой держа офтальмологический прямой пинцет для фиксации глазного яблока, а правой рукой держите хирургическое лезвие, сделайте продольный разрез на 2 мм рядом с местом хрусталика.
  3. Отрежьте роговицу офтальмологическими ножницами вдоль разреза, аккуратно снимите хрусталик, стекловидное тело и обнажите наглазник.
  4. Поместите дно наглазника на кончик микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл, поверните наглазник над трубкой и обнажите сетчатку (сетчатка имеет бледно-желтый цвет).
  5. Удалите всю сетчатку вдоль склеральной стенки глазного яблока с помощью офтальмологического гнущегося пинцета, затем поместите ее в замороженную пробирку и храните в резервуаре с жидким азотом для дальнейшего использования (рисунок 1).

3. Забор сетчатки для патологоанатомического исследования и специфического окрашивания клеток

  1. Левой рукой используйте пинцет для глаз, чтобы приподнять уголок глаза крысы. Правой рукой с помощью хирургического лезвия вырезайте отверстие диаметром 4 мм вдоль угла глаза крысы.
  2. С помощью пинцета для глаз зажмите край глазного яблока в отверстии в левой руке. С помощью офтальмологических ножниц отрежьте окружающие ткани по краю глазного яблока, уделяя при этом внимание очистке окружающих тканей глазного яблока.
  3. Отделите ткани вокруг зрительного нерва на заднем полюсе глазного яблока с помощью пинцета, перережьте зрительный нерв и обратите внимание на его сохранение. Затем удалите глазное яблоко.
  4. Промойте удаленное глазное яблоко в физрастворе, чтобы удалить остатки крови, прокатайте его на фильтровальной бумаге, чтобы впитать лишнюю воду, и положите на холодную фольгу.
  5. Зафиксируйте глаз с помощью офтальмологического пинцета. Хирургическим лезвием сделайте продольный разрез 4 мм вдоль стыка роговицы и сетчатки.
  6. Удалите роговицу офтальмологических ножницами, сделайте круговой надрез вдоль разреза, аккуратно удалите хрусталик и стекловидное тело.
  7. Поместите оставшийся наглазник со зрительным нервом в закладную коробку и зафиксируйте его в 4% параформальдегиде.
  8. Поместить в параформальдегид фиксированные образцы в парафин и нарезать на ломтики размером 4 мкм для окрашивания HE и окрашивания TUNEL7.

4. HE-окрашивание сетчатки глаза крысы

  1. Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 10 минут, повторите процесс еще 10 минут, затем абсолютный этанол в течение 5 минут, повторите обработку этанолом еще 5 минут, затем обработайте 95% спиртом в течение 5 минут, затем в 85% спирте на 5 минут и, наконец, в 75% спирте на 5 минут.
  2. Окрашивание гематоксилином: Промойте ломтик деионизированной водой в течение 5 минут. Используйте 100 μл раствора для окрашивания гематоксилина и окрашивайте в течение 5 минут, смывайте деионизированной водой в течение 5-10 секунд. Добавьте 100 μл 1% этанола соляной кислоты на 30 с, промойте деионизированной водой в течение 20 мин и добавьте 100 мкл 0,2% аммиачной воды на 1 мин. Смыть деионизированной водой в течение 5 минут.
  3. Окрашивание эозином: Используйте 100 мкл раствора для окрашивания эозина в течение 5 минут и прополощите деионизированной водой в течение 30 секунд.
  4. Обезвоживание и запечатывание: Погрузите ломтики в 70% спирт на 5 минут, затем в 85% спирт на 5 минут, затем 90% спирт на 5 минут и абсолютный этанол на 5 минут. Повторите обработку абсолютным этанолом еще 5 минут, затем погрузите в ксилол на 5 минут и повторяйте процесс еще 5 минут. Наконец, запечатайте, добавив примерно 100 мкл нейтральной смолы на поверхность ломтиков, а затем накройте ее покровным стеклом.
  5. Визуализация предметных стекол: расположите окрашенные срезы на микроскопе, отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока изображение не станет четко видимым, установите увеличение в 400x и сделайте снимок.
  6. Измерьте общую толщину сетчатки и внешнюю толщину сетчатки: Измерьте общую толщину сетчатки и внешнюю толщину сетчатки (толщину внешнего ядерного слоя и слоя фоторецептора), а также рассчитайте процент толщины наружной сетчатки
    Толщина наружной сетчатки (%) = (толщина наружной сетчатки/общая толщина сетчатки) x 100.

5. Определение скорости апоптоза фоторецепторных клеток сетчатки методом TUNEL

  1. Депарафинизация и гидратация: поместите ломтики в ксилол на 10 минут, повторите процесс еще 10 минут, затем поместите в абсолютный этанол на 5 минут и повторяйте этот шаг еще 5 минут. Выполните обезвоживание, поместив 95% спирт на 5 минут, 90% спирт на 5 минут, 80% спирт на 5 минут, 70% спирт на 5 минут и промыть деионизированной водой в течение 5 минут.
  2. Промыть 0,85% раствором натрия хлорида в течение 5 мин и PBS в течение 5 мин. Закрепить параформальдегидом с использованием 4% параформальдегида на 15 минут. Промойте PBS в течение 5 минут, и повторяйте процесс еще 5 минут.
  3. Инкубация и равновесие7: Инкубировать с раствором протеиназы К 20 мкг/мл для разложения в течение 15 мин, уравновешивать в равновесном буфере в течение 10 мин и инкубировать с рекомбинантным концевым буфером дезоксинуклеотидилтрансферазы (rTdT) при 37 °C в течение 60 мин.
  4. Реакция остановки: Добавьте 100 μL в стандартный раствор цитрата (2x раствор SSC) в течение 15 минут. Промойте PBS в течение 5 минут, и повторяйте процесс еще 5 минут.
  5. Ядерный краситель: Добавить 100 μL 4', реагент 6-диамидин-2-фениндл (DAPI) в течение 5 мин. Промойте деионизированной водой в течение 5 минут, и повторите процесс еще 5 минут.
  6. Герметизация: Протрите излишки ксилола вокруг ломтиков и запечатайте, добавив примерно 100 мкл нейтральной смолы на поверхность ломтиков, а затем накройте ее покровным стеклом.
  7. Микроскопия: поместите окрашенные срезы на микроскоп, отрегулируйте фокус микроскопа для четкой видимости, установите увеличение до 400x и сделайте снимок. Наблюдайте за зеленой флуоресценцией на длине волны 520 ± 20 нм с помощью стандартного флуоресцентного фильтра. Обратите внимание на синий DAPI на длине волны 460 нм.
  8. Рассчитайте частоту апоптоза: измерьте значения зеленой флуоресценции и синей флуоресценции внешнего слоя ядра сетчатки. Рассчитайте частоту апоптоза следующим образом:
    Частота апоптозных клеток = значение зеленой флуоресценции/значение синей флуоресценции x 100.

6. Вестерн-блоттинг 10

  1. Лечение лизисным буфером: измельчите и гомогенизируйте одну замороженную сетчатку 50 мкл холодного лизисного буфера (1 мл лизисного буфера, содержащего 5 мкл ингибитора фосфатазы, 1 мкл ингибитора протеазы и 5 мкл 100 мМ PMSF).
  2. При условии ультразвуковой обработки с частотой 28 кГц в течение 5 с на ледяной бане; Повторите 3 раза. Центрифугируйте при 4 °C в течение 5 минут при 10 000 x g для удаления клеточного мусора. Держите надосадочную жидкость.
  3. em>6.3Количественное определение белка: Определение концентрации белка с помощью набора реагентов для анализа белка BCA.
  4. em>6.4Электрофорез: Загрузить образец белка 50 мкг и разделить на 12% электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE).
  5. Перенос на мембрану: Электрофоретический перенос на мембраны из ПВДФ с использованием системы электрофоретического переноса.
  6. Подразделяйте мембраны: Подразделяйте мембраны и анализируйте каждый интересующий белок, β-актин и GAPDH из одного переноса.
  7. Блокировка: Заблокируйте мембраны на 1 ч в TBST, содержащем 5% обезжиренного молока комнатной температуры.
  8. Инкубация первичного антитела: инкубация с первичным антителом расщепленной каспазы-9 (разведение 1:200), расщепленной каспазы-3 (разведение 1:200), расщепленной каспазы-7 (разведение 1:200) и β-актина (разведение 1:1000) в течение ночи при 4 °C. Промойте мембраны с TBST в течение 5 минут, повторите 3 раза.
  9. Инкубируйте второе антитело: Инкубируйте с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000) в течение 2 ч при комнатной температуре. Промойте мембраны с TBST в течение 5 минут, повторите 3 раза.
  10. Экспозиция: Визуализируйте меченые белки с помощью субстрата вестерн-блоттинга и, наконец, обнажите мембраны для визуализации белковых полос в автоматическом режиме экспозиции.
  11. Рассчитайте содержание белка7 , измерив плотность полосы белка.

7. Статистический анализ

  1. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения SPSS 19.0 и представьте их в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Выполнение статистического анализа наблюдаемых значений с использованием одностороннего дисперсионного анализа. Примем p< 0,05 как статистически значимый.

Результаты

После окрашивания HE все слои сетчатки крыс контрольной группы имели четкую тканевую структуру, упорядоченное расположение клеток и равномерное окрашивание, при этом структура сетчатки крыс модельной группы была значительно повреждена, наружный слой сетчатки оказа?...

Обсуждение

РП является распространенным заболеванием сетчатки в клиниках. Начало, тяжесть и прогрессирование РП связаны с генами и генетическими модусами и зависят от окружающей среды 8,11. РП включает семейный РП и эпизодический РП, из которых сем...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Научно-исследовательским проектом Департамента высшего образования города Нинся (NYG2022029).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham ImagerGE680
Ammonium persulfate Boster Biological Technology Co.,LtdA8090
Analytical BalanceMettler ToledoME104E
BCA protein quantization kit Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP902
cleaved caspase-3 antibodyCell Signaling Technology#9664
cleaved caspase-7 antibodyCell Signaling Technology#8438
cleaved caspase-9 antibodyCell Signaling Technology#9507
DeadEnd Fluorometric TUNEL SystemPromegaG3250
Glycine Boster Biological Technology Co.,LtdAR1200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)Bioss Antibodiesbs-80295G-HRP
Goat serumBiosharpBL210A
High speed  crusherThermo Fisher ScientificAG22331
Immobilon-P SQ Transfer membranesMerck Millipore. LtdISEQ00010
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
MethanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Microplate ReaderThermo Fisher Scientific1510
MicroscopeOlympusIX73
Microscope slideCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-Methyl-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766–100G
OvenShanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Page Pre-solution (30% )Doublehelix Biology Science and Technology Co.,LtdL3202A
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26617
PBS bufferBiosharpG4202
SDS-PAGE Protein loading buffer (5×)Beyotime BiotechnologyP0015
Skim milk powderBioFroxx1172GR500
Sprague Dawley ratsNingxia Medical UniversitySCXK (Ning) 2020-0001
TEMED Boster Biological Technology Co.,LtdAR1165
Total protein extraction kit Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP2100
Trans-Blot ModuleBIO-RAD1703935
Tris base Boster Biological Technology Co.,LtdAR1162
Tweezer Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-actinCell Signaling Technology#4970

Ссылки

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486 (2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836 (2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55 (2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741 (2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001 (2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661 (2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857 (2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497 (2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

N NTUNEL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены