Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الالتهام الشحمي هو شكل انتقائي من الالتهام الذاتي الذي ينطوي على تدهور قطرات الدهون. ترتبط الاختلالات الوظيفية في هذه العملية بتطور السرطان. ومع ذلك، فإن الآليات الدقيقة ليست مفهومة تماما بعد. يصف هذا البروتوكول مناهج التصوير الكمي لفهم التفاعل بين الالتهام الذاتي واستقلاب الدهون وتطور السرطان بشكل أفضل.

Abstract

الالتهام الذاتي الكبير ، الذي يشار إليه عادة باسم الالتهام الذاتي ، هو عملية خلوية محفوظة للغاية مسؤولة عن تدهور المكونات الخلوية. هذه العملية بارزة بشكل خاص في ظل ظروف مثل الصيام أو الإجهاد الخلوي أو تلف العضيات أو التلف الخلوي أو شيخوخة المكونات الخلوية. أثناء الالتهام الذاتي ، يتم وضع جزء من السيتوبلازم داخل حويصلات مزدوجة الغشاء تعرف باسم البلعمة الذاتية ، والتي تندمج بعد ذلك مع الجسيمات الحالة. بعد هذا الاندماج ، تخضع محتويات الجسيمات الذاتية لتدهور سائب غير انتقائي تسهله الجسيمات الحالة ومع ذلك ، فإن الالتهام الذاتي يظهر أيضا وظائف انتقائية ، حيث يستهدف عضيات معينة ، بما في ذلك الميتوكوندريا والبيروكسيسومات والليزوزومات والنوى وقطرات الدهون (LDs). يتم إحاطة قطرات الدهون بطبقة أحادية الفوسفوليبيد التي تعزل الدهون المحايدة من السيتوبلازم ، مما يحمي الخلايا من الآثار الضارة للستيرولات الزائدة والأحماض الدهنية الحرة (FFAs). الالتهام الذاتي متورط في حالات مختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية واضطرابات التمثيل الغذائي والسرطان. على وجه التحديد ، يلعب التهام الشحمي - التحلل المعتمد على الالتهام الذاتي لقطرات الدهون - دورا مهما في تنظيم مستويات FFA داخل الخلايا عبر حالات التمثيل الغذائي المختلفة. يدعم هذا التنظيم العمليات الأساسية مثل تخليق الغشاء وتكوين جزيء الإشارات وتوازن الطاقة. وبالتالي ، فإن ضعف التهام الشحمي يزيد من قابلية الخلية لمحفزات الموت ويساهم في تطور أمراض مثل السرطان. على الرغم من أهميتها ، إلا أن الآليات الدقيقة التي تحكم عملية التمثيل الغذائي لقطرات الدهون التي تنظمها الالتهام الدهني في الخلايا السرطانية لا تزال غير مفهومة جيدا. تهدف هذه المقالة إلى وصف اكتساب التصوير متحد البؤر وبروتوكولات تحليل التصوير الكمي التي تتيح التحقيق في التهام الدهني المرتبط بالتغيرات الأيضية في الخلايا السرطانية. قد تلقي النتائج التي تم الحصول عليها من خلال هذه البروتوكولات الضوء على التفاعل المعقد بين الالتهام الذاتي والتمثيل الغذائي للدهون وتطور السرطان. من خلال توضيح هذه الآليات ، قد تظهر أهداف علاجية جديدة لمكافحة السرطان والأمراض الأخرى المرتبطة بالتمثيل الغذائي.

Introduction

الالتهام الذاتي هو مصطلح عام يستخدم لوصف العمليات التقويضية التي تنقل فيها الخلية مكوناتها إلى الليزوزوم للتحلل. حتى الآن ، تم تحديد ثلاثة أنواع من الالتهام الذاتي: الالتهام الذاتي الدقيق ، والالتهام الذاتي الكلي ، والالتهام الذاتي بوساطةالمرافق 1،2،3. الالتهام الذاتي الكبير ، المشار إليه فيما يلي باسم الالتهام الذاتي ، هو مسار أساسي لتنظيم التوازن الخلوي. يمكن أن يؤدي تعطيل هذا التوازن إلى تطور الحالات المرضية4.

الالتهام الذاتي هو عملية معقدة تتضمن خطوات متعددة. الخطوة الأولى هي تحريض الالتهام الذاتي ، الذي يتم تشغيله بواسطة محفزات مختلفة مثل سحب عوامل النمو (الأنسولين وعوامل النمو الشبيهة بالأنسولين) ، والالتهابات المسببة للأمراض ، وانخفاض مستويات الطاقة الخلوية (ATP) ، والإجهاد خارج الخلية أو داخل الخلايا (على سبيل المثال ، نقص الأكسجة ، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والإجهاد التأكسدي) ، ونقص المغذيات (الأحماض الأمينية والجلوكوز)5. تتضمن الخطوة الثانية تكوين البلعمة ، حيث يبدأ عزل الغشاء من ER وغشاء البلازما والميتوكوندريا. يتضمن تكوين De novo آلية محفوظة لبروتينات العصارة الخلوية التي يتم تجنيدها بالتتابع6 ، مثل مركب كيناز الشبيه ب Unc-51 (ULK1: ATG1 في الخميرة) ، Beclin-1 ، و VPS347. بعد تكوين مركب ULK1 ، يتم تجنيد مركب الفوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز من الفئة الثالثة (PI3K) في الغشاء المعزول (IM) ، والذي يعمل في العزل الأولي للشحنات8. علاوة على ذلك ، فإن مجمع ULK1 لديه القدرة على تجنيد ATG9 في غشاء العزل (IM) ، وهي خطوة أساسية حيث يتم التعرف على حويصلات ATG9 على أنها ناقلات غشائية تسهل توسع الحقن العضلي9.

يعد نظاما اقتران يشبهان اليوبيكويتين (Ubl) أمرا بالغ الأهمية لعملية التوسع: نظام السلسلة الخفيفة 3 (LC3-I) المرتبط بالأنابيب الدقيقة ونظامATG12 10. قبل الاقتران ، تخضع السلائف LC3 للانقسام. ثم يتم اقتران LC3-I العصاري الخلوي مع الفوسفاتيديل إيثانولامين (PE) لإنتاج LC3-PE المرتبط بالغشاء (LC3-II) ، مما يسهل تكوين البلعمةالذاتية 11. يجب استيعاب الشحنة في الجسيم الذاتي ذو الغشاء المزدوج أثناء هذه العملية. يمكن للالتهام الذاتي استيعاب الأهداف العشوائية للتدهور أو التقاط الشحنات الانتقائية من خلال مستقبلات الالتهام الذاتي المحددة مثل p62 / SQSTM112. الخطوة الأخيرة هي اندماج البلعمة الذاتية المشكلة مع الجسيمات الحالة ، مما يؤدي إلى تكوين الجسيم الذاتي. على الرغم من أن الآلية الدقيقة لتكوين الجسيم الذاتي لا تزال بعيدة المنال ، إلا أن مجمعات الربط الغشائي ، والبروتين المرتبط ب GTP المرتبط ب RAS ، وبروتينات مستقبلات البروتين المرتبط بعامل الارتباط بعامل N-ethylmaleimide القابلة للذوبان (SNARE) تشارك في عملية الاندماجهذه 13. علاوة على ذلك ، فإن نظام الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة ضروري لتهريب الجسيمات الذاتية الناضجة والليزوسومات من مواقع البدء العشوائية باتجاه المنطقة المحيطة بالنواة لتكوين الجسيمات الذاتية14،15،16. في الجسيم الذاتي ، تتحلل الشحنات المعزولة بشكل عشوائي أو انتقائي بشكل بروتيني بواسطة البروتياز الليزوزومي17.

يتم الحفاظ على عملية الالتهام الذاتي عبر جميع الكائنات حقيقية النواة وهي ضرورية في تنظيم الظروف داخل الخلايا من خلال دوران السيتوبلازم. يزيل البروتينات غير المطوية أو المجمعة ، ويزيل مسببات الأمراض داخل الخلايا ، ويزيل العضيات التالفة. تم الإبلاغ عن العديد من العضيات ، بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والبيروكسيسومات ، والليزوسومات ، والنواة ، و LDs ، كأهداف للالتهام الذاتي16،18،19،20،21،22. تنشأ LDs من غرفة الطوارئ وهي عضيات تخزين أساسية مركزية لتوازن الدهون والطاقة. تتكون بنيتها المتميزة من نواة كارهة للماء من الدهون المحايدة محاطة بطبقة أحادية من الدهون الفوسفورية مدمجة ببروتينات معينة. يمكن أن تتفاعل هذه القطرات مع العضيات الخلوية المختلفة من خلال مواقع ملامسة الغشاء23. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد الالتهام الذاتي على إعادة تدوير الموارد الأولية للحفاظ على الظروف الخلوية المثلى. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي تدهور LDs إلى إنتاج ATP من خلال الأحماض الدهنية β أكسدة24.

يرتبط الالتهام الذاتي بأمراض مختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية واضطرابات التمثيل الغذائي والسرطان17. يمكن أن يعزز الالتهام الذاتي أو يمنع نمو الورم في السرطان ، اعتمادا على السياق25،26. على سبيل المثال ، تظهر الفئران Beclin 1 +/- نسبة عالية من الأورام اللمفاوية والسرطانات في أعضاء مثل الرئة والكبد والأنسجة الثديية. على العكس من ذلك ، فإن فقدان الجين المرتبط بالالتهام الذاتي Atg7 في الخلايا الظهارية المعوية يخفف من نمو الورم المدفوع بفقدان مثبط الورم الأساسي في سرطان القولون والمستقيم ، السلائل القولونية الغدية القولونية (APC) 27،28. وبالتالي ، فإن فقدان الجينات المرتبطة بالالتهام الذاتي يمكن أن يكون له تأثيرات معاكسة على نمو الورم.

يجب أن تنتج الخلايا السرطانية الطاقة للحفاظ على نموها وانقسامها وبقائهاعلى قيد الحياة 29. لديهم شغف عال للدهون ، والتي تستخدم في التخليق الحيوي للمكونات الهيكلية وإنتاج الطاقة30. يمكن للخلايا السرطانية تكييف عملية التمثيل الغذائي مع الظروف البيئية. على سبيل المثال ، عندما يتم قمع تحلل السكر في خلايا HeLa المشتقة من سرطان عنق الرحم ، يتم زيادة الفسفرة المؤكسدة للحصول على ATP اللازم للبقاءعلى قيد الحياة 31. لا توجد الدهون في الخلية على أنها FFAs غير أسترية بسبب سميتها الخلوية المحتملة بتركيزات عالية. بدلا من ذلك ، تخزن الخلايا FFAs والكوليسترول كجزيئات حيوية محايدة وخاملة مثل استرات الستيرول والدهون الثلاثية في LDs32. وبالتالي ، يمكن أن يساهم التهام الدهني في استقلاب السرطان من خلال توفير FFAs لإنتاج الطاقة ، وهو مجال ناشئ في أبحاث السرطان. ومع ذلك ، فإن المسارات التي تنظم أكسدة FA للميتوكوندريا في الخلايا السرطانية لا تزال غير مفهومة جيدا. ثبت أن امتصاص FFAs وتراكمه يعزز عدوانية أنواع السرطان المختلفة33،34،35. تعد إعادة برمجة التمثيل الغذائي للدهون سمة مميزة لإعادة برمجة التمثيل الغذائي للسرطان ، حيث تلعب دورا محوريا كاستجابة تكيفية لإدارة السيناريوهات الفسيولوجية الضارة في البيئة المكروية للورم36،37. في الواقع ، لوحظ تراكم LDs في العديد من السرطانات البشرية ، بما في ذلك سرطانات الرئة والثدي والبروستاتا ، ويرتبط بالعدوانية والتشخيص السريريالضعيف 38،39،40.

نظرا لأهمية الالتهام الذاتي و LDs في استقلاب السرطان والآليات غير المفهومة جيدا ، من الضروري وضع بروتوكولات لدراسة مساهمتها في تطور السرطان. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتقييم الالتهام الشحمي من خلال اكتساب التصوير متحد البؤر وبروتوكولات تحليل التصوير الكمي للتحقيق في التغيرات الأيضية الدهنية في الخلايا السرطانية.

Protocol

أجريت هذه الدراسة باستخدام خلايا HeLa الغدية الظهارية (CCL2 ، ATCC). يركز البروتوكول على دراسة قطرات الدهون (LDs) أثناء تحريض الالتهام الدهني في الخلايا الحية لتحديد المسار الزمني لتباين عدد LD وتفاعلات الجسيمات الذاتية LD في الخلايا التي تعبر عن النوع البري (p62 / SQSTM1-S182S) وطفرتين خاصتين بالموقع لمستقبلات الالتهام الذاتي p62 / SQSTM116. يزيد التعبير عن شكل معيب من الفوسفو (p62 / SQSTM1-S182A) من عدد LDs ، بينما يقلل التعبير عن شكل محاكي الفوسفو (p62 / SQSTM1-S182E) من عدد LDs16. أولا ، يتم وصف طريقة لتحليل LDs في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. بعد ذلك ، يتم شرح بروتوكول الحصول على الصور غير المتحيزة والآلية بالكامل وتحليلها باستخدام مجهر متحد البؤر الآلي. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تصوير الخلايا الحية متحد البؤر

  1. زراعة الخلايا
    1. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، مع استكمال مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ v / v (FBS) ، و 1,000 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و Amphotericin B. الحفاظ على الخلايا حتى لا تصل إلى أكثر من 80٪ التقاء.
    2. اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x ، واجمعها باستخدام 0.25٪ v / v trypsin / EDTA ، وأجهزة الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    4. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة DMEM مع 10٪ v/v FBS والبذور (0.05 × 106 خلايا / بئر) في أطباق ذات قاع زجاجي 35 مم.
    5. قم بنقل الخلايا باستخدام TransIT-LT1 أو كاشف Lipofectamine 2000. استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد لكل متغيرات فوسفو p62 / SQSTM1-mcherry والنوع البري p62 / SQSTM1-mcherry16.
    6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة قبل الشروع في العلاجات اللاحقة.
      ملاحظة: بعد 16-24 ساعة من التعدي ، يشكل p62 / SQSTM1 مكثفات كبيرة بدلا من الجسيمات الذاتية المنفصلة p62 / SQSTM1. تتبدد هذه المكثفات الكبيرة إلى حد كبير بعلامة 48 ساعة ، مما يسمح بمراقبة أكثر دقة للبلعمة الذاتية.
  2. وضع العلامات على العضية
    1. اغسل الخلايا في طبق ذو قاع زجاجي مرتين باستخدام 1x PBS (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية).
    2. احتضان الخلايا ب BODIPY 493/503 المخفف إلى 0.5 ميكرومتر في وسط DMEM مكمل ب 10 ملي مولار HEPES واحتفظ بها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. يمكن أيضا استخدام BODIPY 405 و BODIYPY 633 بنفس النتائج.
    3. تحقق من أن التعبير عن متغيرات p62 / SQSTM1 يؤدي إلى تغييرات في عدد LDs وشدة التألق الإجمالية.
    4. اغسل الخلايا ب 1x PBS (درجة حرارة الغرفة) واحتفظ بها في DMEM خال من الفينول الأحمر مكمل بمخزن HEPES مؤهل من 10 ملي مولار ES لتصوير الخلايا الحية.
      ملاحظة: ينبعث من BODIPY 493/503 مضان أخضر ساطع ، مما يجعله مناسبا لوضع العلامات المزدوجة على التألق. ومع ذلك ، في ظل ظروف معينة ، مثل الإثارة المتكررة ، يمكن أن ينبعث منها مضان أحمر ، مما قد يؤدي إلى تفسيرات خاطئة (تحديد موقع خاطئ) عند دمجه مع علامات حمراء. لمزيد من المعلومات حول فلوروفورات الإثارة 550 نانومتر ، راجع مقال Ohsaki et al.41.
  3. الحصول على صورة الفحص المجهري متحد البؤر في تصوير الخلايا الحية
    ملاحظة: يتم الحصول على صور LDs باستخدام مجهر متحد البؤر بهدف غمر الزيت 63x (NA 1.4). تم استخدام برنامج متوافق للحصول على الصور لالتقاط الصور. يتم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام التحكم الآلي في درجة الحرارة.
    ملاحظة: تم الحصول على صور قطرات الدهون (LDs) باستخدام مجهر متحد البؤر مع هدف غمر الزيت 63x (NA 1.4). تم استخدام برنامج الحصول على الصور المتوافق لالتقاط الصور. تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية باستخدام نظام آلي للتحكم في درجة الحرارة.
    1. اضبط ليزر غاز الأرجون متعدد الخطوط على 10٪ من طاقة العمل ، مع خط ليزر 488 نانومتر بقوة عمل 1٪ -2٪ ، مما ينتج عنه طاقة ليزر إجمالية تبلغ 0.1٪ -0.2٪.
    2. لتقليل تلف الخلايا وتحقيق التبييض الضوئي ، اضبط ليزر 568 نانومتر على فاعلية 3٪ -5٪.
    3. اضبط إعدادات الحصول على الصور في البرنامج على دقة 1024 × 1024 بكسل. يستخدم النظام كاشفا هجينا يعمل بسرعة 600 هرتز ، بمتوسط 2.
    4. اضبط النطاقات الطيفية بين 478-494 نانومتر (الانبعاث الأخضر ل LDs) والطول الموجي 600-625 نانومتر (الانبعاث الأحمر ل mCherry).
    5. اضبط حجم الثقب على 1 وحدة جيدة التهوية (AU) للطول الموجي 488 نانومتر.
    6. احتضان الخلايا باستخدام 8-Br-cAMP (100 مللي مولار) لتنشيط PKA kinase وزيادة تدهور LDs16.
    7. التقط صورا فلورية بفواصل زمنية مدتها 5 دقائق ، 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  4. تحليل الصور
    1. افتح ملف مكدس يحتوي على تسلسلات صور حية فردية باستخدام ImageJ. استخدم مدير العائد على الاستثمار لتجزئة الخلايا يدويا. حفظ المناطق للخطوة التالية.
    2. افتح ملف المكدس واستدعاء المناطق المحفوظة لكل صورة. ضبط حد قناة LDs.
    3. قم بقياس شدة التألق الإجمالية عن طريق تحديد مقياس متعدد على مدير عائد الاستثمار.
      ملاحظة: أثناء الالتهام الذاتي ، يمكن أن تتغير شدة التألق الإجمالية وعدد LDs بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، تزداد التفاعلات بين LDs والليزوزومات أثناء تحريض الالتهام الذاتي.
  5. تحليل جهات الاتصال والموقع المشترك
    1. قم بإجراء التقاط متعدد الأطياف على فترات 1 ثانية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. اضبط ليزر غاز الأرجون متعدد الخطوط على فعالية 10٪ ، مع خط ليزر 488 نانومتر بقوة عمل 0.1٪ -0.5٪ لتقليل تلف الخلايا وتحقيق التبييض الضوئي. اضبط ليزر 568 نانومتر على فاعلية 3٪ -5٪.
    3. انقر فوق ComDet V: الإضافات < ComDet V 0.5.3 < اكتشاف الجسيمات. حدد الحد الأدنى للمسافة التي يجب أن تعتبر النقاط متوضعية.
    4. اختر المعلمات التي تحدد الجسيم، مثل حجمه (مم أو وحدة البكسل) والعتبة لكلتا القناتين بشكل مستقل. سيتم توفير ملخص بعدد الجسيمات في كل قناة لكل مرة والنسبة المئوية للتوطين المقابل ، والتي يمكن تصديرها إلى Excel (انظر الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: يوصى باستخدام المكون الإضافي ComDet V للعضيات ذات الشكل البيضاوي ، مثل قطرات الدهون أو الجسيمات الداخلية أو البيروكسيسومات أو الجسيمات الحالة. لا ينصح بالتمركز مع العضيات مثل الميتوكوندريا. يسمح المكون الإضافي "ComDet V" (توزيع ImageJ FIJI) بتحليل التحديد الزمني من خلال تحليل الجسيمات. لتثبيته في فيجي ، انسخ عنوان URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ ، وانتقل إلى التعليمات ، والتحديث ، وحدد إدارة مواقع التحديث - إضافة موقع التحديث والصق عنوان URL. تطبيق التغييرات. يوصى باستخدام قناتين. إذا كان هناك المزيد من القنوات، افصلها وأعد الانضمام إليها باستخدام الدمج.
  6. الحركة الديناميكية ل LDs
    1. تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) للخرز والخلايا وحفظها. انتقل إلى المكونات الإضافية وحدد Tracking و TrackMate.
    2. افتح TrackMate. توفر النافذة الأولى للمكون الإضافي معلومات حول الفترات الزمنية التي يتم فيها التقاط الصور ودقة الصورة. لتأكيد الفواصل الزمنية دون إجراء تغييرات ، انقر فوق التالي.
    3. حدد كاشف LoG ثم التالي. في تكوين كاشف LoG ، قم بتصفية الجسيمات وفقا لقطرها ، من 0.8-1.0 ميكرون ، وحدد عتبة مناسبة. قم بإجراء معاينة لتأكيد المعلمات المناسبة ، وانقر فوق التالي.
    4. قم بتعيين الحد الأولي، وهو حد جودة يحد من عدد المواقع المراد تحليلها. هذا مطلوب عند اتباع العديد من البقع على متن الطائرة ، وهو أمر صعب. لا تستخدم الفلتر. اضغط على NEXT دون تغيير المعلمات.
    5. حدد طريقة عرض: اختر HyperStack Displayer وانقر فوق التالي.
    6. حدد متتبع LAP للحركة الخطية للجسيمات ذات السرعة الثابتة في المستوى.
    7. حدد الحد الأقصى للمسافة بين نقطتين عند بدء مسار جديد. اعتمادا على الصور ، يقترح أن تكون بين 0.5 -1 ميكرون.
    8. قم بتعيين الحد الأقصى للمسافة من الموضع المتوقع للمواقع المرشحة للتحليل.
    9. قم بتعيين الحد الأقصى لفجوة الإطار كأقصى وقت لمتابعة بقعة قد تختفي من المستوى البؤري. نوصي بنقطتين زمنيتين.
    10. حدد خيارات العرض. يتم تصدير جدول الملخص، بما في ذلك الحد الأدنى للسرعة، والسرعة القصوى، ومتوسط السرعة، ومتوسط السرعة، وإزاحة المسار، إلى Excel (راجع الملف التكميلي 2).
    11. حدد ميزات المؤامرة. لتمثيل النتائج بشكل مرئي، انتقل إلى المسارات. حدد المقياس لتمثيل (السرعة والإزاحة) على المحور X ، ويتم وضع البقع على المحور Y.
    12. حدد إجراء لحفظ مقاطع الفيديو التي تعرض حركة الأماكن. هذا يسمح بتصور البقع التي تظهر تغييرات كبيرة.
      ملاحظة: يؤدي تعزيز الالتهام الذاتي إلى تحسين التدفق الخلوي وتقليل عدد LD ، مما يسلط الضوء على دوره الحاسم في تنظيم التمثيل الغذائي والتوازن الخلوي16. المكونات الإضافية المذكورة متاحة لبرنامج ImageJ (توزيع FIJI). يمكن أيضا استخدام البرامج المكافئة. بالنسبة لجميع قياسات شدة التألق ، تم استخدام كثافة التألق المتكاملة ("RawIntDen" في ImageJ) ، والتي تمثل إجمالي التألق عبر كل بكسل صورة ، مع مراعاة المنطقة.

2. الحصول على الصور متحد البؤر المؤتمتة بالكامل وتحليل الصور في الخلايا الثابتة

ملاحظة: تسمح هذه الطريقة بتقييم العديد من الشروط وتطوير قياسات ثلاثية لكل حالة ، مما يحسن الثقة في متوسط القيم المقاسة ويتيح تحديد الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للتمايز الإحصائي بين التجارب. يتم تصوير سير عمل الطريقة في المخطط الانسيابي الموضح في الشكل 1.

  1. زراعة الخلية
    1. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، مع 10٪ v / v مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1,000 U / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و Amphotericin B.
    2. اغسل الخلايا ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) ، يتم حصاده باستخدام 0.25٪ من التربسين / EDTA.
    3. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    4. الطرد المركزي للخلايا في درجة حرارة الغرفة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    5. قم بشفط المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة واحتفظ بحبيبات الخلية.
    6. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط استزراع DMEM مع 10٪ v/v FBS والبذور في ألواح 96 بئر قاعية بصرية (0.05 × 106 خلايا / بئر).
      ملاحظة: يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة قبل الشروع في العلاجات اللاحقة.
  2. تحريض الالتهام الذاتي عن طريق تجويع المصل
    1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا واحتضان الخلايا في وسط DMEM المحروم من المصل لإزالة المصل وتحفيز الالتهام الذاتي لمدة 6 ساعات.
    2. استخدم بافيلومايسين A1 200 نانومتر لتثبيط التهام الشحمي LD. مثبط ثنائي الجلسرين أسيل ترانسفيراز -1 (DGAT1) T863 (50 ميكرومتر) يثبط التكوين الحيوي LD. استخدم مثبط كارنيتين بالميتويل ترانسفيراز I (CPT1) إيتوموكسير (100 ميكرومتر) لتثبيط تحويل FFAs إلى أسيل كارنيتين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تثبيط تحلل الدهون باستخدام ATGLstatin (10 ميكرومتر).
  3. تثبيت الخلية
    1. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS-CM المثلج (200 ميكرولتر / بئر).
    2. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد مخفف في PBS مكمل ب 0.1 ملي مولار CaCl2 و 1 ملي مولار MgCl2 (PBS-CM) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقةو 16.
    3. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS-CM (200 ميكرولتر / بئر).
    4. تخلل مع 0.2٪ Triton X-100 في PBS-CM في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS-CM.
  4. وضع العلامات على العضية
    1. احتضان الخلايا باستخدام BODIPY 493/503 المخفف عند 0.5 ميكرومتر و DAPI (125 مجم / مل) في PBS-CM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. يغسل ثلاث مرات باستخدام PBS-CM.
    3. احتفظ بالخلايا الثابتة والملطخة في 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر حتى الحصول على الصورة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الصفيحة المكونة من 96 بئرا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أسابيع ، محمية من الضوء والجفاف. التركيب باستخدام وسائط التثبيت المضادة للبهتان شائعة الاستخدام غير مطلوب.
  5. الفحص المجهري متحد البؤر الآلي (الخلايا الثابتة)
    1. قم بإجراء تلطيخ النوى لتجزئة الصور الآلي16.
      ملاحظة: يستخدم الحصول على الصور مجهر قرص دوار مع هدف غمر الماء 40x (NA 1.1). يتم إجراء الحصول على DAPI باستخدام إضاءة LED 305 نانومتر (على سبيل المثال: 355-385 نانومتر ؛ Em: 430-500 نانومتر) ، ويتم إجراء اقتناء BODIPY 493/503 باستخدام إضاءة LED 488 نانومتر (على سبيل المثال: 460-490 نانومتر ؛ Em: 550-550 نانومتر).
  6. تحليل الصور
    ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصور16 باستخدام برنامج متوافق مع وحدة تحليل LD مخصصة. يحتوي البرنامج المستخدم في هذه الدراسة (انظر جدول المواد) على مزيج خوارزمية حل جاهز (RMS Lipid Droplet Analysis) لتجزئة الصور وقياسها كميا.
    1. حدد النوى عن طريق تحديد قناة DAPI واضبط العتبة بناء على الإشارة والخلفية.
    2. تحديد السيتوبلازم. حدد الطريقة المناسبة استنادا إلى قناة مضان LDs.
    3. حدد البقع عن طريق ضبط المعلمات: نصف القطر (1-1.5 ميكرومتر) ، التباين (0.2-0.25) ، كثافة البقعة إلى المنطقة غير المصححة (0.4-0.6) ، المسافة (0.3-0.4 ميكرومتر) ، نصف قطر ذروة البقعة (0.2-0.25 ميكرومتر).
    4. حساب خصائص الترميل: حدد LDs للسكان ونقطة المنطقة والطريقة القياسية ، ثم حدد المنطقة.
    5. حساب خصائص الكثافة: حدد قناة LDs وLDs للسكان ونقطة المنطقة والطريقة القياسية .
    6. حساب الخصائص: حدد عدد سكان جميع الخلايا ، وحدد الطريقة حسب LDs ذات الصلة بالسكان ، ثم حدد عدد LDs والمساحة والكثافة (المتوسط والمجموع ؛ المجموع هو كثافة / كثافة مضان متكاملة). سيؤدي ذلك إلى قياسات LD المتعلقة بالخلية.
    7. حدد النتائج عن طريق تحديد الإخراج القياسي وعدد الكائنات وعدد LDs لكل خلية معبرا عنها كمتوسط ± SD ومتوسط LDs لكل منطقة وإجمالي LDs لكل منطقة وكسور LD لكل منطقة وإجمالي كثافة LDs.

النتائج

تصوير الخلايا الحية متحد البؤر
LDs ديناميكية وتتفاعل بشكل عابر مع الجسيمات الذاتية الإيجابية p62 / SQSTM1. عندما يتم تحفيز الالتهام الدهني ، تقلل هذه التفاعلات من عدد LDs وكثافتها الفلورية الإجمالية. استخدم هذا البروتوكول إصدارات فوسفو متحولة من مستقبلات الالتهام ا?...

Discussion

قدمت تقنيات التصوير الكمي ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر وبروتوكولات تحليل الصور ، رؤى قيمة حول ديناميكيات LDs أثناء التهام الشحمي16،42،43. تتيح هذه التقنيات التصور في الوقت الفعلي وتحديد عدد LDs ، مما يسمح بتحليل عددها وحجم...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم تمويل المجهر متحد البؤر الآلي Operetta بواسطة منحة Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) رقم EQM220072. تم دعم C.L. من قبل Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID) ، منحة الدكتوراه بجامعة سان سيباستيان. تم دعم CS من قبل منحة Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). وحظي D.T. و J.C. بدعم من منحة Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

References

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
  2. Mejlvang, J., et al. Starvation induces rapid degradation of selective autophagy receptors by endosomal microautophagy. J Cell Biol. 217 (10), 3640-3655 (2018).
  3. Kaushik, S., Cuervo, A. M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (6), 365-381 (2018).
  4. Galluzzi, L., Pietrocola, F., Levine, B., Kroemer, G. Metabolic control of autophagy. Cell. 159 (6), 1263-1276 (2014).
  5. He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet. 43, 67-93 (2009).
  6. Suzuki, K., Ohsumi, Y. Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (pas). FEBS Lett. 584 (7), 1280-1286 (2010).
  7. Neufeld, T. P. Contribution of ATG1-dependent autophagy to tor-mediated cell growth and survival. Autophagy. 3 (5), 477-479 (2007).
  8. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of ATG proteins in autophagosome formation. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 107-132 (2011).
  9. Mari, M., et al. An ATG9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190 (6), 1005-1022 (2010).
  10. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian ATG proteins. Autophagy. 6 (6), 764-776 (2010).
  11. Kabeya, Y., et al. LC3, GABARAP AND GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-ii formation. J Cell Sci. 117 (Pt 13), 2805-2812 (2004).
  12. Ahmad, R., et al. P62/SQSTM1 binds with claudin-2 to target for selective autophagy in stressed intestinal epithelium. Commun Biol. 6 (1), 740 (2023).
  13. Bento, C. F., et al. Mammalian autophagy: How does it work. Annu Rev Biochem. 85, 685-713 (2016).
  14. Jahreiss, L., Menzies, F. M., Rubinsztein, D. C. The itinerary of autophagosomes: From peripheral formation to kiss-and-run fusion with lysosomes. Traffic. 9 (4), 574-587 (2008).
  15. Pu, J., Guardia, C. M., Keren-Kaplan, T., Bonifacino, J. S. Mechanisms and functions of lysosome positioning. J Cell Sci. 129 (23), 4329-4339 (2016).
  16. Tapia, D., et al. KDEL receptor regulates secretion by lysosome relocation- and autophagy-dependent modulation of lipid-droplet turnover. Nat Commun. 10 (1), 735 (2019).
  17. Ichimiya, T., et al. Autophagy and autophagy-related diseases: A review. Int J Mol Sci. 21 (23), 8974 (2020).
  18. Ciechanover, A. Proteolysis: From the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  19. Khaminets, A., et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature. 522 (7556), 354-358 (2015).
  20. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death Differ. 20 (1), 31-42 (2013).
  21. Koerver, L., et al. The ubiquitin-conjugating enzyme ube2ql1 coordinates lysophagy in response to endolysosomal damage. EMBO Rep. 20 (10), e48014 (2019).
  22. Deosaran, E., et al. NBR1 acts as an autophagy receptor for peroxisomes. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 939-952 (2013).
  23. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (3), 137-155 (2019).
  24. Xu, C., Fan, J. Links between autophagy and lipid droplet dynamics. J Exp Bot. 73 (9), 2848-2858 (2022).
  25. White, E. The role for autophagy in cancer. J Clin Invest. 125 (1), 42-46 (2015).
  26. Amaravadi, R. K., Kimmelman, A. C., Debnath, J. Targeting autophagy in cancer: Recent advances and future directions. Cancer Discov. 9 (9), 1167-1181 (2019).
  27. Levy, J., et al. Intestinal inhibition of ATG7 prevents tumour initiation through a microbiome-influenced immune response and suppresses tumour growth. Nat Cell Biol. 17 (8), 1062-1073 (2015).
  28. Trentesaux, C., et al. Essential role for autophagy protein ATG7 in the maintenance of intestinal stem cell integrity. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (20), 11136-11146 (2020).
  29. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (review). Oncol Lett. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  30. Martin-Perez, M., Urdiroz-Urricelqui, U., Bigas, C., Benitah, S. A. The role of lipids in cancer progression and metastasis. Cell Metab. 34 (11), 1675-1699 (2022).
  31. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9 (1), 18699 (2019).
  32. Danielli, M., Perne, L., Jarc Jovicic, E., Petan, T. Lipid droplets and polyunsaturated fatty acid trafficking: Balancing life and death. Front Cell Dev Biol. 11, 1104725 (2023).
  33. Butler, L. M., et al. Lipids and cancer: Emerging roles in pathogenesis, diagnosis and therapeutic intervention. Adv Drug Deliv Rev. 159, 245-293 (2020).
  34. Nagarajan, S. R., Butler, L. M., Hoy, A. J. The diversity and breadth of cancer cell fatty acid metabolism. Cancer Metab. 9 (1), 2 (2021).
  35. Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipids in cancer: A global view of the contribution of lipid pathways to metastatic formation and treatment resistance. Oncogenesis. 11 (1), 46 (2022).
  36. Yang, K., et al. The role of lipid metabolic reprogramming in tumor microenvironment. Theranostics. 13 (6), 1774-1808 (2023).
  37. Tan, Y., et al. Metabolic reprogramming from glycolysis to fatty acid uptake and beta-oxidation in platinum-resistant cancer cells. Nat Commun. 13 (1), 4554 (2022).
  38. Safi, R., Menendez, P., Pol, A. Lipid droplets provide metabolic flexibility for cancer progression. FEBS Lett. 598 (10), 1301-1327 (2024).
  39. Iwahashi, N., et al. Lipid droplet accumulation independently predicts poor clinical prognosis in high-grade serous ovarian carcinoma. Cancers (Basel). 13 (20), 5251 (2021).
  40. Luo, W., et al. Adding fuel to the fire: The lipid droplet and its associated proteins in cancer progression. Int J Biol Sci. 18 (16), 6020-6034 (2022).
  41. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using bodipy dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 133 (4), 477-480 (2010).
  42. Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: Regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Dev Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
  43. Nguyen, T. B., Olzmann, J. A. Lipid droplets and lipotoxicity during autophagy. Autophagy. 13 (11), 2002-2003 (2017).
  44. Giamogante, F., et al. A SPLICS reporter reveals-synuclein regulation of lysosome-mitochondria contacts which affects TFEB nuclear translocation. Nat Commun. 15 (1), 1516 (2024).
  45. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  46. Nguyen, T. B., et al. DGAT1-dependent lipid droplet biogenesis protects mitochondrial function during starvation-induced autophagy. Dev Cell. 42 (1), 9-21.e5 (2017).
  47. Murugan, S., Amaravadi, R. K. Methods for studying autophagy within the tumor microenvironment. Adv Exp Med Biol. 899, 145-166 (2016).
  48. Mallela, S. K., et al. Detection and quantification of lipid droplets in differentiated human podocytes. Methods Mol Biol. 1996, 199-206 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved