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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Lipophagie ist eine selektive Form der Autophagie, bei der Lipidtröpfchen abgebaut werden. Funktionsstörungen in diesem Prozess werden mit der Entstehung von Krebs in Verbindung gebracht. Die genauen Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll beschreibt quantitative Bildgebungsansätze, um das Zusammenspiel zwischen Autophagie, Fettstoffwechsel und Krebsprogression besser zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Makroautophagie, allgemein als Autophagie bezeichnet, ist ein hochkonservierter zellulärer Prozess, der für den Abbau zellulärer Komponenten verantwortlich ist. Dieser Prozess ist besonders ausgeprägt unter Bedingungen wie Fasten, zellulärem Stress, Organellenschäden, zellulären Schäden oder der Alterung zellulärer Komponenten. Während der Autophagie wird ein Segment des Zytoplasmas von Doppelmembranvesikeln, den sogenannten Autophagosomen, eingeschlossen, die dann mit Lysosomen fusionieren. Nach dieser Fusion wird der Inhalt der Autophagosomen einem nicht-selektiven Massenabbau unterzogen, der durch Lysosomen erleichtert wird. Die Autophagie weist jedoch auch eine selektive Funktionalität auf, die auf bestimmte Organellen abzielt, darunter Mitochondrien, Peroxisomen, Lysosomen, Zellkerne und Lipidtröpfchen (LDs). Lipidtröpfchen sind von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben, die neutrale Lipide aus dem Zytoplasma isoliert und die Zellen vor den schädlichen Auswirkungen von überschüssigen Sterolen und freien Fettsäuren (FFAs) schützt. Autophagie ist an verschiedenen Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs. Insbesondere spielt die Lipophagie - der autophagieabhängige Abbau von Lipidtröpfchen - eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der intrazellulären FFA-Spiegel über verschiedene Stoffwechselzustände hinweg. Diese Regulation unterstützt essentielle Prozesse wie die Membransynthese, die Bildung von Signalmolekülen und den Energiehaushalt. Folglich erhöht eine gestörte Lipophagie die zelluläre Anfälligkeit für Todesreize und trägt zur Entwicklung von Krankheiten wie Krebs bei. Trotz seiner Bedeutung sind die genauen Mechanismen, die den durch Lipophagie regulierten Fetttröpfchenstoffwechsel in Krebszellen steuern, nach wie vor wenig verstanden. Dieser Artikel zielt darauf ab, die konfokale Bildgebung und quantitative bildgebende Analyseprotokolle zu beschreiben, die die Untersuchung der Lipophagie im Zusammenhang mit metabolischen Veränderungen in Krebszellen ermöglichen. Die Ergebnisse, die durch diese Protokolle erzielt werden, könnten Aufschluss über das komplizierte Zusammenspiel zwischen Autophagie, Fettstoffwechsel und Krebsprogression geben. Durch die Aufklärung dieser Mechanismen können neue therapeutische Angriffspunkte für die Bekämpfung von Krebs und anderen stoffwechselbedingten Krankheiten entstehen.

Einleitung

Autophagie ist ein allgemeiner Begriff, der verwendet wird, um katabole Prozesse zu beschreiben, bei denen die Zelle ihre Bestandteile zum Abbau zum Lysosom transportiert. Bisher wurden drei Arten von Autophagie identifiziert: Mikroautophagie, Makroautophagie und Chaperon-vermittelte Autophagie 1,2,3. Die Makroautophagie, im Folgenden als Autophagie bezeichnet, ist ein wesentlicher Weg zur Regulierung der zellulären Homöostase. Eine Störung dieses Gleichgewichts kann zur Entwicklung pathologischer Zustände führen4.

Autophagie ist ein komplexer Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Der erste Schritt ist die Autophagie-Induktion, ausgelöst durch verschiedene Reize wie den Entzug von Wachstumsfaktoren (Insulin und insulinähnliche Wachstumsfaktoren), pathogene Infektionen, verminderte zelluläre Energieniveaus (ATP), extrazellulären oder intrazellulären Stress (z. B. Hypoxie, Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER), oxidativer Stress) und Nährstoffmangel (Aminosäuren, Glukose)5. Der zweite Schritt beinhaltet die Bildung des Phagophors, bei dem die Membranisolierung aus dem ER, der Plasmamembran und den Mitochondrien eingeleitet wird. Die De-novo-Bildung beinhaltet eine konservierte Maschinerie zytosolischer Proteine, die sequentiell rekrutiert werden6, wie z. B. die Ser/Thr-Kinase Unc-51-like kinase-1 complex (ULK1: ATG1 in Hefe), Beclin-1 und VPS347. Nach der Bildung des ULK1-Komplexes wird der Klasse-III-Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Komplex I an die isolierte Membran (IM) rekrutiert, die bei der initialen Sequestrierung der Ladungen8 eine Rolle spielt. Darüber hinaus hat der ULK1-Komplex die Fähigkeit, ATG9 an die Isolationsmembran (IM) zu rekrutieren, ein wesentlicher Schritt, da ATG9-Vesikel als Membranträger anerkannt sind, die die IM-Expansionerleichtern 9.

Zwei Ubiquitin-ähnliche (Ubl) Konjugationssysteme sind entscheidend für den Expansionsprozess: das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1 Light Chain 3 (LC3-I) System und das ATG12 System10. Vor der Konjugation wird der LC3-Vorläufer gespalten. Das zytosolische LC3-I wird dann an Phosphatidylethanolamin (PE) konjugiert, um das membranassoziierte LC3-PE (LC3-II) zu produzieren, das die Bildung von Autophagosomen erleichtert11. Während dieses Prozesses muss die Fracht in das sich bildende Doppelmembran-Autophagosom internalisiert werden. Die Autophagie kann zufällige Ziele für den Abbau internalisieren oder selektive Frachten durch spezifische Autophagierezeptoren wie p62/SQSTM112 einfangen. Der letzte Schritt ist die Fusion des gebildeten Autophagosoms mit den Lysosomen, was zur Bildung von Autolysosomen führt. Obwohl der genaue Mechanismus für die Autolysosomenbildung noch schwer fassbar ist, sind Membran-Tethering-Komplexe, das RAS-verwandte GTP-bindende Protein und die löslichen N-ethylmaleimid-sensitive factor attachment protein receptors (SNARE)-Proteine an diesem Fusionsprozess beteiligt13. Darüber hinaus ist das Mikrotubuli-Zytoskelett-System essentiell für den Transport reifer Autophagosomen und Lysosomen von zufälligen Initiationsstellen in den perinukleären Bereich für die Autolysosomenbildung 14,15,16. Im Autolysosom werden die zufällig oder selektiv sequestrierten Ladungen proteolytisch durch lysosomale Proteasen abgebaut17.

Der Autophagieprozess ist in allen eukaryotischen Organismen konserviert und entscheidend für die Regulierung intrazellulärer Bedingungen durch den zytoplasmatischen Umsatz. Es entfernt fehlgefaltete oder aggregierte Proteine, eliminiert intrazelluläre Krankheitserreger und beseitigt beschädigte Organellen. Mehrere Organellen, darunter das endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien, Peroxisomen, Lysosomen, Zellkern und LDs, wurden als Ziele der Autophagie berichtet 16,18,19,20,21,22. LDs stammen aus dem ER und sind essentielle Speicherorganellen, die für die Lipid- und Energiehomöostase von zentraler Bedeutung sind. Ihre ausgeprägte Architektur besteht aus einem hydrophoben Kern aus neutralen Lipiden, der von einer Phospholipid-Monoschicht umgeben ist, die in spezifische Proteine eingebettet ist. Diese Tröpfchen können über Membrankontaktstellen mit verschiedenen zellulären Organellen interagieren23. Darüber hinaus hilft die Autophagie, primäre Ressourcen zu recyceln, um optimale zelluläre Bedingungen aufrechtzuerhalten. So kann beispielsweise der Abbau von LDs zur ATP-Produktion durch Fettsäure-β-Oxidationführen 24.

Autophagie wird mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Stoffwechselstörungen und Krebs17. Autophagie kann das Tumorwachstum bei Krebs je nach Kontext fördern oder hemmen25,26. Zum Beispiel weisen Beclin 1 +/- Mäuse eine hohe Inzidenz von spontanen Lymphomen und Karzinomen in Organen wie der Lunge, der Leber und dem Brustgewebe auf. Umgekehrt schwächt der Verlust des Autophagie-bezogenen Gens Atg7 in Darmepithelzellen das Tumorwachstum ab, das durch den Verlust des primären Tumorsuppressors bei Darmkrebs, adenomatöser Polyposis coli (APC), angetrieben wird27,28. So kann der Verlust von Autophagie-bezogenen Genen gegensätzliche Auswirkungen auf das Tumorwachstum haben.

Krebszellen müssen Energie produzieren, um ihr Wachstum, ihre Teilung und ihr Überleben aufrechtzuerhalten29. Sie haben eine hohe Avidität für Lipide, die für die Biosynthese von Strukturbestandteilen und die Energiegewinnung verwendet werden30. Krebszellen können ihren Stoffwechsel an die Umweltbedingungen anpassen. Wenn beispielsweise die Glykolyse in HeLa-Zellen aus Gebärmutterhalskrebs unterdrückt wird, wird die oxidative Phosphorylierung erhöht, um das für das Überleben notwendige ATP zu erhalten31. Lipide in einer Zelle existieren aufgrund ihrer potenziellen Zytotoxizität bei hohen Konzentrationen nicht als nicht veresterte FFAs. Stattdessen speichern Zellen FFAs und Cholesterin als neutrale, inerte Biomoleküle wie Sterolester und Triglyceride in LDs32. Folglich kann die Lipophagie zum Krebsstoffwechsel beitragen, indem sie FFAs zur Energieerzeugung liefert, ein aufstrebendes Gebiet in der Krebsforschung. Die Signalwege, die die mitochondriale FA-Oxidation in Krebszellen hochregulieren, sind jedoch nach wie vor wenig verstanden. Es wurde gezeigt, dass die Aufnahme und Akkumulation von FFAs die Aggressivität verschiedener Krebsarten erhöht 33,34,35. Die Reprogrammierung des Lipidstoffwechsels ist ein Kennzeichen der metabolischen Reprogrammierung von Krebs und spielt eine zentrale Rolle als adaptive Reaktion zur Bewältigung ungünstiger physiologischer Szenarien in der Tumormikroumgebung36,37. In der Tat wurde eine Akkumulation von LDs bei vielen Krebsarten beim Menschen beobachtet, einschließlich Lungen-, Brust- und Prostatakrebs, und ist mit Aggressivität und schlechter klinischer Prognose verbunden 38,39,40.

Angesichts der Bedeutung von Autophagie und LDs im Krebsstoffwechsel und der wenig verstandenen Mechanismen ist es wichtig, Protokolle zur Untersuchung ihres Beitrags zur Krebsentstehung zu erstellen. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Bewertung der Lipophagie durch konfokale Bildgebung und quantitative Bildgebungsanalyseprotokolle zur Untersuchung von lipidmetabolischen Veränderungen in Krebszellen.

Protokoll

Diese Studie wurde mit epithelialen Adenokarzinom-HeLa-Zellen (CCL2, ATCC) durchgeführt. Das Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung von Lipidtröpfchen (LDs) während der Induktion von Lipophagie in lebenden Zellen, um den zeitlichen Verlauf der LD-Anzahlvariation und der LD-Autophagosomen-Wechselwirkungen in Zellen zu quantifizieren, die den Wildtyp (p62/SQSTM1-S182S) exprimieren, und zwei ortsspezifische Mutanten des Autophagierezeptors p62/SQSTM116. Die Expression einer phospho-defekten Form (p62/SQSTM1-S182A) erhöht die Anzahl der LDs, während die Expression einer phospho-imitierenden Form (p62/SQSTM1-S182E) die Anzahl der LDs reduziert16. Zunächst wird eine Methode zur Analyse von LDs in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie beschrieben. Anschließend wird das Protokoll für die unvoreingenommene, vollautomatische Bilderfassung und -analyse anhand eines robotergestützten konfokalen Mikroskops erläutert. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konfokale Bildgebung lebender Zellen

  1. Zellkultur
    1. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % v/v fötalem Rinderserum (FBS), 1.000 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und Amphotericin B. Halten Sie die Zellen so lange aufrecht, bis sie eine Konfluenz von nicht mehr als 80 % erreichen.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, sammeln Sie mit 0,25 % v/v Trypsin/EDTA und zentrifugieren Sie sie bei 100 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
    4. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM-Kulturmedium mit 10 % v/v FBS und Seed (0,05 x 106 Zellen/Well) in 35-mm-Glasbodenschalen.
    5. Transfizieren Sie die Zellen mit TransIT-LT1-Transfektion oder Lipofectamine 2000-Reagenz. Es wird 1 μg Plasmid-DNA jeder p62/SQSTM1-mcherry-Phospho-Variante und des Wildtyps p62/SQSTM1-mcherry16 verwendet.
    6. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 , bevor Sie mit den nachfolgenden Behandlungen fortfahren.
      HINWEIS: 16-24 h nach der Transfektion bildet p62/SQSTM1 große Kondensate anstelle von diskreten p62/SQSTM1-Autophagosomen. Diese großen Kondensate lösen sich bis zur 48-Stunden-Marke weitgehend auf, was eine genauere Beobachtung der Autophagosomen ermöglicht.
  2. Beschriftung von Organellen
    1. Die Zellen in einer Glasbodenschale zweimal mit 1x PBS (auf 37 °C vorgeheizt) waschen.
    2. Inkubieren Sie die Zellen mit BODIPY 493/503 verdünnt auf 0,5 μM in DMEM-Medium, das mit 10 mM HEPES versetzt ist, und bewahren Sie sie 30 min lang bei 37 °C, 5 % CO2 auf. BODIPY 405 und BODIYPY 633 können ebenfalls mit den gleichen Ergebnissen verwendet werden.
    3. Es ist zu überprüfen, ob die Expression der p62/SQSTM1-Varianten zu Veränderungen der LD-Anzahl und der Gesamtfluoreszenzintensität führt.
    4. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS (Raumtemperatur) und bewahren Sie sie in rot-phenolfreiem DMEM auf, ergänzt mit 10 mM ES-qualifiziertem HEPES-Puffer für die Bildgebung lebender Zellen.
      HINWEIS: BODIPY 493/503 emittiert hellgrüne Fluoreszenz und eignet sich daher für die doppelte Fluoreszenzmarkierung. Unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. wiederholter Anregung, kann es jedoch rote Fluoreszenz emittieren, was in Kombination mit roten Markern möglicherweise zu fehlerhaften Interpretationen (falsche Kolokalisation) führt. Weitere Informationen zu 550 nm Anregungsfluorophoren finden Sie im Artikel von Ohsaki et al.41.
  3. Konfokale Mikroskopie-Bildaufnahme in der Lebendzell-Bildgebung
    HINWEIS: Bilder von LDs wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fach-Ölimmersionsobjektiv (N.A. 1.4) aufgenommen. Für die Aufnahme der Bilder wurde eine kompatible Bilderfassungssoftware verwendet. Die Temperatur wird durch ein automatisiertes Temperaturregelsystem auf 37 °C gehalten.
    HINWEIS: Bilder von Lipidtröpfchen (LDs) wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv (N.A. 1.4) aufgenommen. Für die Aufnahme der Bilder wurde eine kompatible Bilderfassungssoftware verwendet. Die Temperatur wurde mit Hilfe eines automatisierten Temperaturregelungssystems auf 37 °C gehalten.
    1. Stellen Sie den Multilinien-Argon-Gaslaser auf 10 % Arbeitsleistung ein, wobei die 488-nm-Laserlinie eine Arbeitsleistung von 1 % bis 2 % hat, was zu einer Gesamtlaserleistung von 0,1 % bis 0,2 % führt.
    2. Um Zellschäden zu minimieren und Photobleaching zu sondieren, stellen Sie den 568-nm-Laser auf eine Potenz von 3 % bis 5 % ein.
    3. Passen Sie die Bildaufnahmeeinstellungen in der Software auf eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixel an. Das System verwendet einen Hybriddetektor, der mit einem Durchschnitt von 600 Hz arbeitet, mit einem Durchschnitt von 2.
    4. Stellen Sie die Spektralbereiche zwischen 478-494 nm (grüne Emission für LDs) und 600-625 nm Wellenlänge (rote Emission für mCherry) ein.
    5. Stellen Sie die Lochblendengröße auf 1 Airy Unit (AU) für eine Wellenlänge von 488 nm ein.
    6. Inkubieren Sie die Zellen mit 8-Br-cAMP (100 mM), um die PKA-Kinase zu aktivieren und den Abbau von LDs zu erhöhen16.
    7. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder in 5-Minuten-Intervallen und 37 °C für 60 Minuten auf.
  4. Bildanalyse
    1. Öffnen Sie mit ImageJ eine Stack-Datei mit einzelnen Live-Bildsequenzen. Verwenden Sie den ROI-Manager für die manuelle Zellsegmentierung. Speichern Sie die Regionen für den nächsten Schritt.
    2. Öffnen Sie die Stapeldatei und rufen Sie gespeicherte Bereiche für jedes Bild auf. Passen Sie den Schwellenwert des LD-Kanals an.
    3. Messen Sie die Gesamtfluoreszenzintensität, indem Sie im ROI-Manager die Option "Multi-Measure" auswählen.
      HINWEIS: Während der Autophagie können sich die Gesamtfluoreszenzintensität und die Anzahl der LDs erheblich ändern. Darüber hinaus nehmen die Wechselwirkungen zwischen LDs und Lysosomen während der Autophagie-Induktion zu.
  5. Kontakte und Colokalisierungsanalyse
    1. Führen Sie eine multispektrale Erfassung in 1-s-Intervallen für 5 Minuten bei 37 °C durch.
    2. Stellen Sie den Multilinien-Argongaslaser auf eine Potenz von 10 % ein, während die 488-nm-Laserlinie eine Arbeitsleistung von 0,1 % bis 0,5 % hat, um Zellschäden zu minimieren und Photobleiche zu sondieren. Stellen Sie den 568-nm-Laser auf eine Potenz von 3 % bis 5 % ein.
    3. Klicken Sie auf ComDet V: Plugins < ComDet V 0.5.3 < Partikel erkennen. Definieren Sie den Mindestabstand, den Punkte aufweisen müssen, um als kolokalisiert zu gelten.
    4. Wählen Sie die Parameter aus, die das Partikel definieren, z. B. seine Größe (mm- oder Pixeleinheit) und seinen Schwellenwert, für beide Kanäle unabhängig voneinander. Es wird eine Zusammenfassung mit der Anzahl der Partikel in jedem Kanal für jede Zeit und dem entsprechenden Kolokalisierungsprozentsatz bereitgestellt, die nach Excel exportiert werden kann (siehe Zusatzdatei 1).
      HINWEIS: Das ComDet V-Plugin wird für Organellen mit ovaler Form empfohlen, wie z. B. Lipidtröpfchen, Endosomen, Peroxisomen oder Lysosomen. Es wird nicht für die Kolokalisation mit Organellen wie Mitochondrien empfohlen. Das "ComDet V"-Plugin (ImageJ FIJI-Verteilung) ermöglicht die Analyse der zeitlichen Kolokalisation durch Partikelanalyse. Um es in Fidschi zu installieren, kopieren Sie die URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/, gehen Sie zu Hilfe, Update, wählen Sie Update-Sites verwalten - Update-Site hinzufügen und fügen Sie die URL ein. Übernehmen Sie die Änderungen. Es wird empfohlen, zwei Kanäle zu verwenden. Wenn es mehr Kanäle gibt, trennen Sie sie, und fügen Sie sich mit Zusammenführen wieder zusammen.
  6. Dynamische Bewegung von KS
    1. Definieren Sie Regions of Interest (ROIs) für Perlen und die Zellen und speichern Sie sie. Gehen Sie zu Plugins und wählen Sie Tracking und TrackMate.
    2. Öffnen Sie TrackMate. Das erste Fenster des Plugins gibt Auskunft über die Zeitintervalle, in denen die Bilder aufgenommen werden, und die Bildauflösung. Um Zeitintervalle zu bestätigen, ohne Änderungen vorzunehmen, klicken Sie auf WEITER.
    3. Wählen Sie LoG-Detektor und dann WEITER. In der LoG-Detektorkonfiguration filtern Sie die Partikel nach ihrem Durchmesser von 0,8 bis 1,0 Mikrometern und stellen Sie einen geeigneten Schwellenwert ein. Führen Sie eine Vorschau durch, um die richtigen Parameter zu bestätigen, und klicken Sie auf WEITER.
    4. Legen Sie den anfänglichen Schwellenwert fest, einen Qualitätsschwellenwert, der die Anzahl der zu analysierenden Spots begrenzt. Dies ist erforderlich, wenn man vielen Punkten im Flugzeug folgt, was eine Herausforderung darstellt. Verwenden Sie den Filter nicht. Drücken Sie NEXT , ohne die Parameter zu ändern.
    5. Wählen Sie eine Ansicht aus: Wählen Sie HyperStack Displayer und klicken Sie auf WEITER.
    6. Wählen Sie Linearbewegungs-LAP-Tracker für Partikel mit konstanter Geschwindigkeit in der Ebene aus.
    7. Definieren Sie den maximalen Abstand zwischen zwei Punkten, wenn ein neuer Track gestartet wird. Abhängig von den Bildern wird ein Wert zwischen 0,5 und 1 Mikron empfohlen.
    8. Legen Sie die maximale Entfernung von einer vorhergesagten Position für mögliche Punkte für die Analyse fest.
    9. Legen Sie "Max. Frameabstand " als maximale Zeit fest, die einem Punkt gefolgt werden soll, der möglicherweise aus der Fokusebene verschwindet. Wir empfehlen zwei Zeitpunkte.
    10. Wählen Sie Anzeigeoptionen aus. Die Übersichtstabelle mit der Mindestgeschwindigkeit, der Höchstgeschwindigkeit, der Mittelgeschwindigkeit, der Durchschnittsgeschwindigkeit und der Gleisverschiebung wird nach Excel exportiert (siehe Zusatzdatei 2).
    11. Wählen Sie Features plotten. Um die Ergebnisse visuell darzustellen, gehen Sie zu Spuren. Wählen Sie die darzustellende Kennzahl (Geschwindigkeit und Verschiebung) auf der X-Achse aus, und die Punkte werden auf der Y-Achse platziert.
    12. Wählen Sie eine Aktion aus, um Videos zu speichern, die die Bewegung von Spots zeigen. Dies ermöglicht die Visualisierung von Stellen, die signifikante Veränderungen aufweisen.
      HINWEIS: Die Verbesserung der Autophagie optimiert den zellulären Fluss und reduziert die LD-Zahl, was ihre entscheidende Rolle bei der Stoffwechselregulation und der zellulären Homöostase unterstreicht16. Die genannten Plugins sind für die ImageJ-Software (FIJI-Distribution) verfügbar. Auch entsprechende Software kann verwendet werden. Für alle Messungen der Fluoreszenzintensität wurde die integrierte Fluoreszenzdichte ("RawIntDen" in ImageJ) verwendet, die die Gesamtfluoreszenz über jedes Bildpixel unter Berücksichtigung des Bereichs berücksichtigt.

2. Vollautomatische konfokale Bildaufnahme und Bildanalyse in festen Zellen

HINWEIS: Diese Methode ermöglicht die Bewertung mehrerer Bedingungen und die Entwicklung dreifacher Messungen für jede Bedingung, wodurch die Zuverlässigkeit der durchschnittlichen Messwerte verbessert und die Bestimmung der Standardabweichung oder des Standardfehlers für die statistische Differenzierung zwischen den Experimenten ermöglicht wird. Der Arbeitsablauf der Methode ist in dem in Abbildung 1 gezeigten Flussdiagramm dargestellt.

  1. Zellkultur
    1. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % v/v fötalem Rinderserum (FBS), 1.000 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und Amphotericin B.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die mit 0,25 % v/v Trypsin/EDTA gewonnen wurde.
    3. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur bei 100 x g für 5 min.
    5. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und bewahren Sie das Kügelchen auf.
    6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem DMEM-Kulturmedium mit 10 % v/v FBS und säen Sie es in optische 96-Well-Platten (0,05 x 106 Zellen/Well).
      HINWEIS: Die Zellen werden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bevor mit den nachfolgenden Behandlungen fortgefahren wird.
  2. Autophagie-Induktion durch Serummangel
    1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Zellen in einem DMEM-Medium ohne Serum, um das Serum zu entfernen und die Autophagie für 6 Stunden zu induzieren.
    2. Verwenden Sie Bafilomycin A1 200 nM, um die LD-Lipophagie zu hemmen. Der Diacylglycerin-Acyltransferase-1 (DGAT1)-Hemmer T863 (50 μM) hemmt die LD-Biogenese. Verwenden Sie den Carnitin-Palmitoyltransferase I (CPT1)-Hemmer Etomoxir (100 μM), um die Umwandlung von FFAs in Acyl-Carnitin zu hemmen. Zusätzlich kann die Lipolyse durch die Verwendung von ATGLstatin (10 μM) gehemmt werden.
  3. Fixierung der Zellen
    1. Waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS-CM (200 μL/Well).
    2. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd, verdünnt in PBS, ergänzt mit 0,1 mM CaCl2 und 1 mM MgCl2 (PBS-CM), bei Raumtemperatur für 15 min16.
    3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-CM (200 μL/Well).
    4. Permeabilisieren Sie mit 0,2% Triton X-100 in PBS-CM bei Raumtemperatur für 15 min.
    5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-CM.
  4. Beschriftung von Organellen
    1. Inkubieren Sie die Zellen mit BODIPY 493/503, verdünnt bei 0,5 μM und DAPI (125 mg/ml) in PBS-CM für 30 min bei 37 °C.
    2. Dreimal mit PBS-CM waschen.
    3. Bewahren Sie die fixierten und gefärbten Zellen bis zur Bildaufnahme in 200 μl PBS pro Vertiefung auf.
      HINWEIS: Die 96-Well-Platte kann mehrere Wochen lang bei 4 °C gelagert werden, geschützt vor Licht und Austrocknung. Eine Montage mit den üblicherweise verwendeten Antifading-Einbettmedien ist nicht erforderlich.
  5. Automatisierte konfokale Mikroskopie (fixierte Zellen)
    1. Durchführung von Zellkernfärbungen für eine automatisierte Bildsegmentierung16.
      HINWEIS: Bei der Bildaufnahme wird ein Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 40-fachen (N.A 1.1) Wasserimmersionsobjektiv verwendet. Die DAPI-Erfassung erfolgt mit einer 305-nm-LED-Beleuchtung (Bsp.: 355-385 nm; Em: 430-500 nm), und die Erfassung von BODIPY 493/503 erfolgt mit einer 488-nm-LED-Beleuchtung (Bsp.: 460-490 nm; Em: 550-550 nm).
  6. Bildanalyse
    HINWEIS: Die Bildanalyse16 wird mit einer kompatiblen Software mit einem speziellen KK-Analysemodul durchgeführt. Die in dieser Studie verwendete Software (siehe Materialtabelle) verfügt über eine vorgefertigte Lösungsalgorithmuskombination (RMS Lipid Droplet Analysis) für die Bildsegmentierung und -quantifizierung.
    1. Identifizieren Sie die Kerne, indem Sie den DAPI-Kanal auswählen und den Schwellenwert basierend auf Signal und Hintergrund anpassen.
    2. Identifiziere das Zytoplasma. Wählen Sie die geeignete Methode basierend auf dem Fluoreszenzkanal der LDs.
    3. Identifizieren Sie Spots, indem Sie folgende Parameter anpassen: Radius (1-1,5 μm), Kontrast (0,2-0,25), Unkorrigierte Spot-zu-Region-Intensität (0,4-0,6), Abstand (0,3-0,4 μm), Spot-Peak-Radius (0,2-0,25 μm).
    4. Morphologieeigenschaften berechnen: Wählen Sie Populations-LDs, Region Spot und Standardmethode aus und wählen Sie dann Area aus.
    5. Intensitätseigenschaften berechnen: Wählen Sie LDs-Kanal , Populations-LDs, Region Spot und Standardmethode aus.
    6. Eigenschaften berechnen: Wählen Sie die Grundgesamtheit aller Zellen aus, wählen Sie die Methode nach verwandten Populations-LDs aus, und wählen Sie dann die Anzahl der LDs, die Fläche und die Intensität (Mittelwert und Summe; die Summe ist die integrierte Fluoreszenzdichte/-intensität) aus. Dies führt zu LD-Messungen, die sich auf die Zelle beziehen.
    7. Definieren Sie die Ergebnisse, indem Sie Standardausgabe, Objektanzahl, Anzahl der KKs pro Zelle, ausgedrückt als Mittelwert ± SD, Durchschnittliche KKs pro Fläche, Gesamt-KKs pro Fläche, Bruchteile der KK pro Fläche und Gesamtintensität KAP auswählen.

Ergebnisse

Konfokale Bildgebung lebender Zellen
LDs sind dynamisch und interagieren transient mit p62/SQSTM1-positiven Autophagosomen. Wenn Lipophagie induziert wird, verringern diese Wechselwirkungen die Anzahl der LDs und ihre Gesamtfluoreszenzintensität. Dieses Protokoll verwendete phosphomutierte Versionen des Autophagierezeptors p62/SQSTM1, um diese Effekte zu untersuchen16.

Die Anzahl und Fluoreszenzintensität der LDs w...

Diskussion

Quantitative bildgebende Verfahren wie konfokale Mikroskopie und Bildanalyseprotokolle haben wertvolle Einblicke in die Dynamik von LDs während der Lipophagie geliefert 16,42,43. Diese Technologien ermöglichen die Echtzeit-Visualisierung und Quantifizierung von LDs, was die Analyse ihrer Anzahl, Größe und Wechselwirkungen mit anderen Organellen ermöglicht16. Einer de...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Das robotisierte konfokale Mikroskop Operetta wurde durch den Zuschuss des Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) Nr. EQM220072 finanziert. C.L. wurde unterstützt von der Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), einem Promotionsstipendium der Universidad San Sebastian. C.S. wurde durch das Stipendium der Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID) unterstützt. D.T. und J.C. wurden durch den Zuschuss des Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374 unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

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