JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Lipofaji, lipid damlacıklarının bozulmasını içeren seçici bir otofaji şeklidir. Bu süreçteki işlev bozuklukları kanser gelişimi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kesin mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, otofaji, lipid metabolizması ve kanser ilerlemesi arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için kantitatif görüntüleme yaklaşımlarını açıklar.

Özet

Yaygın olarak otofaji olarak adlandırılan makrootofaji, hücresel bileşenlerin bozulmasından sorumlu, yüksek oranda korunmuş bir hücresel süreçtir. Bu süreç özellikle açlık, hücresel stres, organel hasarı, hücresel hasar veya hücresel bileşenlerin yaşlanması gibi koşullar altında belirgindir. Otofaji sırasında, sitoplazmanın bir bölümü, otofagozomlar olarak bilinen çift zarlı veziküller içine alınır ve bunlar daha sonra lizozomlarla birleşir. Bu füzyonu takiben, otofagozomların içeriği, lizozomlar tarafından kolaylaştırılan seçici olmayan toplu bozunmaya uğrar. Bununla birlikte, otofaji ayrıca mitokondri, peroksizomlar, lizozomlar, çekirdekler ve lipid damlacıkları (LD'ler) dahil olmak üzere belirli organelleri hedef alan seçici işlevsellik sergiler. Lipid damlacıkları, nötr lipidleri sitoplazmadan izole eden, hücreleri aşırı sterollerin ve serbest yağ asitlerinin (FFA'lar) zararlı etkilerinden koruyan bir fosfolipid tek tabakası ile çevrelenir. Otofaji, nörodejeneratif hastalıklar, metabolik bozukluklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli durumlarda rol oynar. Spesifik olarak, lipofaji - lipit damlacıklarının otofajiye bağlı bozunması - farklı metabolik durumlar arasında hücre içi FFA seviyelerinin düzenlenmesinde çok önemli bir rol oynar. Bu düzenleme, zar sentezi, sinyal molekülü oluşumu ve enerji dengesi gibi temel süreçleri destekler. Sonuç olarak, bozulmuş lipofaji, ölüm uyaranlarına karşı hücresel savunmasızlığı artırır ve kanser gibi hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur. Önemine rağmen, kanser hücrelerinde lipofaji tarafından düzenlenen lipid damlacık metabolizmasını yöneten kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu makale, kanser hücrelerinde metabolik değişikliklerle ilişkili lipofajinin araştırılmasını sağlayan konfokal görüntüleme edinimi ve kantitatif görüntüleme analiz protokollerini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu protokoller aracılığıyla elde edilen sonuçlar, otofaji, lipid metabolizması ve kanserin ilerlemesi arasındaki karmaşık etkileşime ışık tutabilir. Bu mekanizmaların aydınlatılmasıyla, kanser ve diğer metabolik ilişkili hastalıklarla mücadelede yeni terapötik hedefler ortaya çıkabilir.

Giriş

Otofaji, hücrenin bileşenlerini bozunma için lizozoma taşıdığı katabolik süreçleri tanımlamak için kullanılan genel bir terimdir. Bugüne kadar üç tür otofaji tanımlanmıştır: mikrootofaji, makrootofaji ve şaperon aracılı otofaji 1,2,3. Bundan böyle otofaji olarak anılacak olan makrootofaji, hücresel homeostazı düzenlemek için önemli bir yoldur. Bu dengenin bozulması patolojik durumların gelişmesine yol açabilir4.

Otofaji, birden fazla adım içeren karmaşık bir süreçtir. İlk adım, büyüme faktörlerinin geri çekilmesi (insülin ve insülin benzeri büyüme faktörleri), patojenik enfeksiyonlar, azalmış hücresel enerji seviyeleri (ATP), hücre dışı veya hücre içi stres (örneğin, hipoksi, endoplazmik retikulum (ER) stresi, oksidatif stres) ve besin eksikliği (amino asitler, glikoz) gibi çeşitli uyaranlar tarafından tetiklenen otofaji indüksiyonudur5. İkinci adım, ER, plazma zarı ve mitokondriden zar izolasyonunun başlatıldığı fagofor oluşumunu içerir. De novooluşumu, Ser / Thr kinaz Unc-51 benzeri kinaz-1 kompleksi (mayada ULK1: ATG1), Beclin-1 ve VPS347 gibi sıralı olarak işe alınan 6 sitozolik proteinlerin korunmuş mekanizmasını içerir. ULK1 kompleksinin oluşumundan sonra, sınıf III fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) kompleksi I, kargoların8 ilk sekestrasyonunda işlev gören izole membrana (IM) alınır. Ayrıca, ULK1 kompleksi, ATG9 veziküllerinin IM genişlemesini kolaylaştıran membran taşıyıcıları olarak kabul edilmesinden bu yana önemli bir adım olan ATG9'u izolasyon membranına (IM) alma yeteneğine sahiptir9.

Genişleme süreci için iki ubikitin benzeri (Ubl) konjugasyon sistemi kritik öneme sahiptir: mikrotübül ile ilişkili protein 1 hafif zincir 3 (LC3-I) sistemi ve ATG12 sistemi10. Konjugasyondan önce, LC3 öncüsü bölünmeye uğrar. Sitozolik LC3-I daha sonra otofagozom oluşumunu kolaylaştıran zarla ilişkili LC3-PE'yi (LC3-II) üretmek için fosfatidiletanolamin (PE) ile konjuge edilir11. Bu işlem sırasında kargo, oluşturan çift zarlı otofagozoma içselleştirilmelidir. Otofaji, bozunma için rastgele hedefleri içselleştirebilir veya p62/SQSTM112 gibi belirli otofaji reseptörleri aracılığıyla seçici kargoları yakalayabilir. Son adım, oluşan otofagozomun lizozomlarla füzyonudur ve otolizozom oluşumuna yol açar. Otolizozom oluşumu için kesin mekanizma belirsiz kalsa da, zar bağlama kompleksleri, RAS ile ilişkili GTP bağlayıcı protein ve çözünür N-etilmaleimide duyarlı faktör bağlanma protein reseptörleri (SNARE) proteinleri bu füzyon sürecinde yer alır13. Ayrıca, mikrotübül hücre iskeleti sistemi, olgun otofagozomların ve lizozomların otolizom oluşumu için rastgele başlatma bölgelerinden perinükleer alana doğru kaçakçılığı için gereklidir 14,15,16. Otolizozomda, rastgele veya seçici olarak tutulan kargolar, lizozomal proteazlar17 tarafından proteolitik olarak bozunur.

Otofaji süreci tüm ökaryotik organizmalarda korunur ve sitoplazmik devir yoluyla hücre içi koşulların düzenlenmesinde çok önemlidir. Yanlış katlanmış veya toplanmış proteinleri uzaklaştırır, hücre içi patojenleri ortadan kaldırır ve hasarlı organelleri temizler. Endoplazmik retikulum, mitokondri, peroksizomlar, lizozomlar, çekirdek ve LD'ler dahil olmak üzere çeşitli organeller otofajinin hedefi olarak bildirilmiştir 16,18,19,20,21,22. LD'ler ER'den kaynaklanır ve lipid ve enerji homeostazının merkezinde yer alan temel depolama organelleridir. Farklı mimarileri, spesifik proteinlerle gömülü bir fosfolipid tek tabakası ile çevrelenmiş hidrofobik bir nötr lipit çekirdeğinden oluşur. Bu damlacıklar, zar temas bölgeleri23 yoluyla çeşitli hücresel organellerle etkileşime girebilir. Ek olarak, otofaji, optimal hücresel koşulları korumak için birincil kaynakların geri dönüştürülmesine yardımcı olur. Örneğin, LD'lerin bozunması, yağ asidi β-oksidasyonu24 yoluyla ATP üretimine yol açabilir.

Otofaji, nörodejeneratif hastalıklar, metabolik bozukluklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilidir17. Otofaji, bağlama bağlı olarak kanserde tümör büyümesini teşvik edebilir veya inhibe edebilir25,26. Örneğin, Beclin 1 +/- fareler, akciğer, karaciğer ve meme dokusu gibi organlarda yüksek oranda spontan lenfoma ve karsinom insidansı sergiler. Tersine, bağırsak epitel hücrelerinde otofaji ile ilişkili gen Atg7'nin kaybı, kolorektal kanserde primer tümör baskılayıcı olan adenomatöz polipozis koli (APC) kaybının neden olduğu tümör büyümesini azaltır27,28. Bu nedenle, otofaji ile ilgili genlerin kaybı, tümör büyümesi üzerinde zıt etkilere sahip olabilir.

Kanser hücreleri büyümelerini, bölünmelerini ve hayatta kalmalarını sürdürmek için enerji üretmelidir29. Yapısal bileşenlerin biyosentezi ve enerji üretimi için kullanılan lipitler için yüksek aviditeye sahiptirler30. Kanser hücreleri metabolizmalarını çevresel koşullara adapte edebilirler. Örneğin, rahim ağzı kanseri kaynaklı HeLa hücrelerinde glikoliz baskılandığında, hayatta kalmak için gerekli ATP'yi elde etmek için oksidatif fosforilasyon arttırılır31. Bir hücredeki lipitler, yüksek konsantrasyonlarda potansiyel sitotoksisiteleri nedeniyle esterleştirilmemiş FFA'lar olarak mevcut değildir. Bunun yerine, hücreler FFA'ları ve kolesterolü LD'lerde sterol esterleri ve trigliseritler gibi nötr, inert biyomoleküller olarak depolar32. Sonuç olarak, lipofaji, kanser araştırmalarında gelişmekte olan bir alan olan enerji üretmek için FFA'lar sağlayarak kanser metabolizmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, kanser hücrelerinde mitokondriyal FA oksidasyonunu yukarı regüle eden yollar tam olarak anlaşılamamıştır. FFA'ların alımı ve birikiminin farklı kanser türlerinin agresifliğini arttırdığı gösterilmiştir 33,34,35. Lipid metabolizmasının yeniden programlanması, kanser metabolik yeniden programlamasının ayırt edici bir özelliğidir ve tümör mikroçevresindeki olumsuz fizyolojik senaryoları yönetmek için uyarlanabilir bir yanıt olarak çok önemli bir rol oynar36,37. Gerçekten de, akciğer, meme ve prostat kanserleri dahil olmak üzere birçok insan kanserinde LD birikimi gözlenmiştir ve agresiflik ve kötü klinik prognoz ile ilişkilidir 38,39,40.

Otofaji ve LD'lerin kanser metabolizmasındaki önemi ve yeterince anlaşılmamış mekanizmalar göz önüne alındığında, kanser gelişimine katkılarını incelemek için protokoller oluşturmak esastır. Bu çalışma, kanser hücrelerinde lipid metabolik değişikliklerini araştırmak için konfokal görüntüleme edinimi ve kantitatif görüntüleme analiz protokolleri yoluyla lipofajiyi değerlendirmek için bir protokolü tanımlamaktadır.

Protokol

Bu çalışma epitelyal adenokarsinom HeLa hücreleri (CCL2, ATCC) kullanılarak yapıldı. Protokol, canlı hücrelerde lipofajinin indüksiyonu sırasında lipid damlacıklarının (LD'ler) incelenmesine odaklanır ve vahşi tip (p62 / SQSTM1-S182S) ve otofaji reseptörü p62 / SQSTM1'in iki bölgeye özgü mutantını ifade eden hücrelerde LD-otofagozom etkileşimlerinin zaman seyrini ölçmek için p62 / SQSTM116. Fosfo-kusurlu bir formun ekspresyonu (p62 / SQSTM1-S182A) LD sayısını arttırırken, fosfo taklit eden bir formun ekspresyonu (p62 / SQSTM1-S182E) LD sayısını azaltır16. İlk olarak, konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücrelerde LD'leri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Daha sonra, robotize bir konfokal mikroskop kullanılarak tarafsız, tam otomatik görüntü elde etme ve analiz protokolü açıklanır. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Konfokal canlı hücre görüntüleme

  1. Hücre kültürü
    1. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO'da kültürleyin 2 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM),% 10 v / v fetal sığır serumu (FBS), 1,000 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve Amfoterisin B. Hücreleri% 80'den fazla birleşmeye ulaşana kadar koruyun.
    2. Hücreleri 1 mL 1x fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın,% 0.25 v / v tripsin / EDTA kullanarak toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.
    4. Hücreleri DMEM kültür ortamında% 10 v / v FBS ve tohum (0.05 x 106 hücre / kuyu) ile 35 mm cam tabanlı tabaklara yeniden süspanse edin.
    5. TransIT-LT1 transfeksiyonu veya Lipofectamine 2000 reaktifi kullanarak hücreleri transfekte edin. Her p62 / SQSTM1-mcherry fosfo varyantlarının ve vahşi tip p62 / SQSTM1-mcherry16'nın 1 μg plazmit DNA'sını kullanın.
    6. Sonraki tedavilere devam etmeden önce hücreleri 37 ° C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
      NOT: Transfeksiyondan 16-24 saat sonra, p62 / SQSTM1, ayrı p62 / SQSTM1 otofagozomları yerine büyük yoğuşmalar oluşturur. Bu büyük yoğunlaşmalar, otofagozomların daha hassas bir şekilde gözlemlenmesine izin vererek, 48 saat işaretiyle büyük ölçüde dağılır.
  2. Organel etiketleme
    1. Hücreleri cam tabanlı bir tabakta 1x PBS (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ile iki kez yıkayın.
    2. Hücreleri, 10 mM HEPES ile desteklenmiş DMEM ortamında 0.5 μM'ye seyreltilmiş BODIPY 493/503 ile inkübe edin ve 37 ° C,% 5 CO2'de 30 dakika bekletin. BODIPY 405 ve BODIYPY 633 de aynı sonuçlarla kullanılabilir.
    3. P62/SQSTM1 varyantlarının ekspresyonunun LD sayısında ve toplam floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olup olmadığını kontrol edin.
    4. Hücreleri 1x PBS (oda sıcaklığı) ile yıkayın ve canlı hücre görüntüleme için 10 mM ES nitelikli HEPES tamponu ile desteklenmiş kırmızı fenol içermeyen DMEM'de tutun.
      NOT: BODIPY 493/503 parlak yeşil floresan yayar, bu da onu çift floresan etiketleme için uygun hale getirir. Bununla birlikte, tekrarlanan uyarma gibi belirli koşullar altında, kırmızı işaretleyicilerle birleştirildiğinde potansiyel olarak hatalı yorumlara (yanlış kolokalizasyon) yol açan kırmızı floresan yayabilir. 550 nm uyarma floroforları hakkında daha fazla bilgi için Ohsaki ve ark.41'in makalesine bakın.
  3. Canlı hücre görüntülemede konfokal mikroskopi görüntü alımı
    NOT: LD'lerin görüntüleri, 63x yağa daldırma objektifine (NA 1.4) sahip bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. Görüntüleri yakalamak için uyumlu bir görüntü elde etme yazılımı kullanıldı. Sıcaklık, otomatik sıcaklık kontrol sistemi kullanılarak 37 °C'de tutulur.
    NOT: Lipid damlacıklarının (LD'ler) görüntüleri, 63x yağa daldırma objektifine (NA 1.4) sahip bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüleri yakalamak için uyumlu görüntü elde etme yazılımı kullanıldı. Sıcaklık, otomatik bir sıcaklık kontrol sistemi kullanılarak 37 °C'de tutuldu.
    1. Çok çizgili argon gazı lazerini %10 çalışma gücüne ayarlayın, 488 nm lazer çizgisi %1 - %2 çalışma gücünde, bu da genel lazer gücü %0,1 - %0,2 ile sonuçlanır.
    2. Hücre hasarını en aza indirmek ve foto ağartmayı en aza indirmek için 568 nm lazeri %3-%5 potansiyele ayarlayın.
    3. Yazılımdaki görüntü alma ayarlarını 1024 x 1024 piksel çözünürlüğe ayarlayın. Sistem, ortalama 600 Hz ile 2 Hz'de çalışan bir hibrit dedektör kullanır.
    4. Spektral aralıkları 478-494 nm (LD'ler için yeşil emisyon) ve 600-625 nm dalga boyu (mCherry için kırmızı emisyon) arasında ayarlayın.
    5. 1 nm dalga boyu için iğne deliği boyutunu 488 Havadar Birim (AU) olarak ayarlayın.
    6. PKA kinazını aktive etmek ve LD'lerin bozulmasını artırmak için hücreleri 8-Br-cAMP (100 mM) ile inkübe edin16.
    7. 5 dakikalık aralıklarla, 37 °C'de 60 dakika boyunca floresan görüntüler yakalayın.
  4. Görüntü analizi
    1. ImageJ kullanarak tek tek canlı görüntü dizileri içeren bir yığın dosyası açın. Manuel hücre segmentasyonu için ROI yöneticisini kullanın. Bir sonraki adım için bölgeleri kaydedin.
    2. Yığın dosyasını açın ve her görüntü için kaydedilen bölgeleri geri çağırın. LDs kanal eşiğini ayarlayın.
    3. ROI yöneticisinde çoklu ölçümü seçerek toplam floresan yoğunluğunu ölçün.
      NOT: Otofaji sırasında, toplam floresan yoğunluğu ve LD sayısı önemli ölçüde değişebilir. Ek olarak, otofaji indüksiyonu sırasında LD'ler ve lizozomlar arasındaki etkileşimler artar.
  5. Kontaklar ve kolokalizasyon analizi
    1. 37 ° C'de 5 dakika boyunca 1 s aralıklarla multispektral bir yakalama gerçekleştirin.
    2. Hücre hasarını en aza indirmek ve foto ağartmayı araştırmak için 488 nm lazer çizgisi %0,1 -%0,5 çalışma gücünde çok çizgili argon gazı lazerini %10 potansiyele ayarlayın. 568 nm lazeri %3-%5 potansiyele ayarlayın.
    3. Parçacıkları algılamak < ComDet V: Plugins < ComDet V 0.5.3'e tıklayın. Noktaların kolokalize olarak kabul edilmesi gereken minimum mesafeyi tanımlayın.
    4. Her iki kanal için de boyutu (mm veya piksel birimi) ve eşiği gibi parçacığı tanımlayan parametreleri bağımsız olarak seçin. Her seferinde her kanaldaki parçacık sayısı ve Excel'e aktarılabilecek karşılık gelen kolokalizasyon yüzdesi ile bir özet sağlanacaktır (bkz. Ek Dosya 1).
      NOT: ComDet V eklentisi, lipid damlacıkları, endozomlar, peroksizomlar veya lizozomlar gibi oval şekilli organeller için önerilir. Mitokondri gibi organellerle kolokalizasyon için önerilmez. "ComDet V" eklentisi (ImageJ FIJI dağılımı), zamansal kolokalizasyonun parçacık analizi yoluyla analiz edilmesini sağlar. Fiji'ye yüklemek için URL'yi http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ kopyalayın, Yardım, Güncelle'ye gidin, Güncelleme sitelerini yönet - Güncelleme sitesi ekle'yi seçin ve URL'yi yapıştırın. Değişiklikleri uygulayın; İki kanal kullanılması tavsiye edilir. Daha fazla kanal varsa, bunları ayırın ve Birleştir'i kullanarak yeniden katılın.
  6. LD'lerin dinamik hareketi
    1. Boncuklar ve hücreler için ilgi alanlarını (ROI'ler) tanımlayın ve kaydedin. Eklentilere gidin ve İzleme ve TrackMate'i seçin.
    2. TrackMate'i açın. Eklentinin ilk penceresi, görüntülerin yakalandığı zaman aralıkları ve görüntü çözünürlüğü hakkında bilgi sağlar. Değişiklik yapmadan zaman aralıklarını onaylamak için İLERİ'ye tıklayın.
    3. LoG dedektörünü ve ardından İLERİ'yi seçin. LoG Dedektör Konfigürasyonunda, partikülleri çaplarına göre 0.8-1.0 mikron arasında filtreleyin ve uygun bir eşik ayarlayın. Uygun parametreleri onaylamak için bir Önizleme gerçekleştirin ve İLERİ'ye tıklayın.
    4. Analiz edilecek nokta sayısını sınırlayan bir kalite eşiği olan başlangıç Eşiği'ni ayarlayın. Bu, uçakta zorlu olan birçok noktayı takip ederken gereklidir. Filtreyi kullanmayın; parametreleri değiştirmeden İLERİ'ye basın.
    5. Bir Görünüm Seçin: HyperStack Displayer'ı seçin ve İLERİ'ye tıklayın.
    6. Düzlemde sabit hıza sahip parçacıklar için Doğrusal hareket LAP izleyicisini seçin.
    7. Yeni bir parkura başlarken iki nokta arasındaki maksimum mesafeyi tanımlayın. Görüntülere bağlı olarak 0,5 -1 mikron arasında olması önerilmektedir.
    8. Analiz için aday noktalar için tahmin edilen bir konuma olan maksimum mesafeyi ayarlayın.
    9. Maksimum Kare Aralığı'nı, odak düzleminden kaybolabilecek bir noktayı takip etmek için maksimum süre olarak ayarlayın. İki zaman noktası öneririz.
    10. Görüntü Seçenekleri'ni seçin. Minimum hız, maksimum hız, ortalama hız, medyan hız ve iz yer değiştirmesi dahil olmak üzere özet tablo Excel'e aktarılır (bkz. Ek Dosya 2).
    11. Arsa Özellikleri'ni seçin. Sonuçları görsel olarak göstermek için İzler'e gidin. X ekseninde temsil edilecek ölçüyü (hız ve yer değiştirme) seçin ve noktalar Y eksenine yerleştirilir.
    12. Noktaların hareketini gösteren videoları kaydetmek için bir Eylem seçin. Bu, önemli değişiklikler gösteren noktaların görselleştirilmesini sağlar.
      NOT: Otofajinin arttırılması, hücresel akıyı optimize eder ve LD sayısını azaltır, metabolik düzenleme ve hücresel homeostazdaki önemli rolünü vurgular16. Bahsedilen eklentiler ImageJ yazılımı (FIJI dağıtımı) için kullanılabilir. Eşdeğer yazılımlar da kullanılabilir. Tüm floresan yoğunluğu ölçümleri için, alan dikkate alınarak her bir görüntü pikselindeki toplam floresanı hesaba katan entegre floresan yoğunluğu (ImageJ'de "RawIntDen") kullanılmıştır.

2. Sabit hücrelerde tam otomatik konfokal görüntü elde etme ve görüntü analizi

NOT: Bu yöntem, birkaç koşulun değerlendirilmesine ve her koşul için üçlü ölçümlerin geliştirilmesine olanak tanır, ortalama ölçülen değerlere olan güveni artırır ve deneyler arasında istatistiksel farklılaşma için standart sapma veya standart hatanın belirlenmesini sağlar. Yöntemin iş akışı, Şekil 1'de gösterilen akış şemasında gösterilmiştir.

  1. Hücre Kültürü
    1. Hücreleri 37 ° C ve% 5 CO'da kültürleyin 2 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM),% 10 v / v fetal sığır serumu (FBS), 1.000 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve Amfoterisin B.
    2. Hücreleri,% 0.25 v / v tripsin / EDTA kullanılarak hasat edilen 1 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
    3. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    4. Hücreleri oda sıcaklığında 100 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı bir pipetle dikkatlice aspire edin ve hücre peletini saklayın.
    6. Hücre peletini DMEM kültür ortamında% 10 v / v FBS ile yeniden süspanse edin ve optik alt 96 oyuklu plakalara (0.05 x 106 hücre / oyuk) tohumlayın.
      NOT: Hücreler, sonraki tedavilere devam etmeden önce 24 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edilir.
  2. Serum açlığı ile otofaji indüksiyonu
    1. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve serumu çıkarmak ve 6 saat boyunca otofajiyi indüklemek için hücreleri serumdan yoksun DMEM ortamında inkübe edin.
    2. LD lipofajiyi inhibe etmek için bafilomisin A1 200 nM kullanın. Diasilgliserol asiltransferaz-1 (DGAT1) inhibitörü T863 (50 μM), LD biyogenezini inhibe eder. FFA'ların asil-karnitine dönüşümünü inhibe etmek için Karnitin Palmitoiltransferaz I (CPT1) inhibitörü Etomoksir (100 μM) kullanın. Ek olarak, ATGLstatin (10 μM) kullanılarak lipoliz inhibe edilebilir.
  3. Hücre fiksasyonu
    1. Hücreleri buz gibi soğuk PBS-CM (200 μL / kuyu) ile üç kez yıkayın.
    2. Hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 0.1 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2 (PBS-CM) ile desteklenmiş PBS'de seyreltilmiş% 4 paraformaldehit ile sabitleyin16.
    3. Hücreleri PBS-CM (200 μL/kuyucuk) ile üç kez yıkayın.
    4. PBS-CM'de% 0.2 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 15 dakika geçirgenleştirin.
    5. Hücreleri PBS-CM ile üç kez yıkayın.
  4. Organel etiketleme
    1. Hücreleri 0.5 μM'de seyreltilmiş BODIPY 493/503 ve PBS-CM'de DAPI (125 mg / mL) ile 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    2. PBS-CM ile üç kez yıkayın.
    3. Sabit ve lekeli hücreleri, görüntü elde edilene kadar kuyu başına 200 μL PBS'de tutun.
      NOT: 96 oyuklu plaka, ışıktan ve dehidrasyondan korunarak birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Yaygın olarak kullanılan antifade montaj ortamı ile montaj gerekli değildir.
  5. Otomatik konfokal mikroskopi (sabit hücreler)
    1. Otomatik görüntü segmentasyonu için çekirdek boyama yapın16.
      NOT: Görüntü elde etme, 40x (NA 1.1) suya daldırma objektifine sahip bir dönen disk mikroskobu kullanır. DAPI alımı, 305 nm LED aydınlatma (Örn: 355-385 nm; Em: 430-500 nm) ve BODIPY 493/503 alımı, 488 nm LED aydınlatma (Örn: 460-490 nm; Em: 550-550 nm).
  6. Görüntü analizi
    NOT: Görüntü analizi16 , özel bir LD analiz modülüne sahip uyumlu yazılım kullanılarak gerçekleştirilir. Bu çalışmada kullanılan yazılım (bkz . Malzeme Tablosu), görüntü segmentasyonu ve miktar tayini için hazır bir çözüm (RMS Lipid Damlacık Analizi) algoritma kombinasyonuna sahiptir.
    1. DAPI kanalını seçerek çekirdekleri tanımlayın ve eşiği sinyale ve arka plana göre ayarlayın.
    2. Sitoplazmayı tanımlayın. LDs floresan kanalına göre uygun yöntemi seçin.
    3. Parametreleri ayarlayarak noktaları tanımlayın: Yarıçap (1-1,5 μm), Kontrast (0,2-0,25), Düzeltilmemiş Nokta Bölge Yoğunluğu (0,4-0,6), Mesafe (0,3-0,4 μm), Nokta Tepe Yarıçapı (0,2-0,25 μm).
    4. Morfoloji özelliklerini hesaplama: Popülasyon LD'lerini, Bölge Spot'unu ve standart yöntemi seçin, ardından Alan'ı seçin.
    5. Yoğunluk özelliklerini hesaplayın: LD kanalını , popülasyon LD'lerini, Bölge Spot'unu ve standart yöntemi seçin.
    6. Özellikleri hesapla: Tüm hücrelerin Popülasyonu'nu seçin, ilgili popülasyon LD'lerine göre yöntemi seçin ve ardından LD sayısını, alanı ve yoğunluğu seçin (ortalama ve toplam; toplam entegre floresan yoğunluğu/yoğunluğudur). Bu, hücre ile ilgili LD ölçümlerini verecektir.
    7. Standart Çıktı, Nesne Sayısı, ortalama ± SD olarak ifade edilen hücre başına LD sayısı, Alan başına ortalama LD, Alan başına Toplam LD, Alan başına LD kesirleri ve Toplam LD yoğunluğu seçerek sonuçları tanımlayın.

Sonuçlar

Konfokal canlı hücre görüntüleme
LD'ler dinamiktir ve geçici olarak p62 / SQSTM1 pozitif otofagozomlarla etkileşime girer. Lipofaji indüklendiğinde, bu etkileşimler LD'lerin sayısını ve toplam floresan yoğunluğunu azaltır. Bu protokol, bu etkileri incelemek için otofaji reseptörü p62 / SQSTM1'in fosfo-mutant versiyonlarını kullandı16.

LD'lerin sayısı ve floresan yoğunluğu, p62 / SQSTM1'in ek...

Tartışmalar

Konfokal mikroskopi ve görüntü analizi protokolleri gibi kantitatif görüntüleme teknikleri, lipofaji sırasında LD'lerin dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlamıştır 16,42,43. Bu teknolojiler, LD'lerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini sağlayarak sayılarının, boyutlarının ve diğer organellerle etkileşimlerinin analizine olanak tanır

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Operetta robotize konfokal mikroskop, Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072 hibesi tarafından finanse edildi. C.L., Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), Universidad San Sebastian Doktora bursu tarafından desteklenmiştir. CS, Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID) bursu tarafından desteklendi. D.T. ve J.C., Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374 hibesi tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

Referanslar

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
  2. Mejlvang, J., et al. Starvation induces rapid degradation of selective autophagy receptors by endosomal microautophagy. J Cell Biol. 217 (10), 3640-3655 (2018).
  3. Kaushik, S., Cuervo, A. M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (6), 365-381 (2018).
  4. Galluzzi, L., Pietrocola, F., Levine, B., Kroemer, G. Metabolic control of autophagy. Cell. 159 (6), 1263-1276 (2014).
  5. He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet. 43, 67-93 (2009).
  6. Suzuki, K., Ohsumi, Y. Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (pas). FEBS Lett. 584 (7), 1280-1286 (2010).
  7. Neufeld, T. P. Contribution of ATG1-dependent autophagy to tor-mediated cell growth and survival. Autophagy. 3 (5), 477-479 (2007).
  8. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of ATG proteins in autophagosome formation. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 107-132 (2011).
  9. Mari, M., et al. An ATG9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190 (6), 1005-1022 (2010).
  10. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian ATG proteins. Autophagy. 6 (6), 764-776 (2010).
  11. Kabeya, Y., et al. LC3, GABARAP AND GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-ii formation. J Cell Sci. 117 (Pt 13), 2805-2812 (2004).
  12. Ahmad, R., et al. P62/SQSTM1 binds with claudin-2 to target for selective autophagy in stressed intestinal epithelium. Commun Biol. 6 (1), 740 (2023).
  13. Bento, C. F., et al. Mammalian autophagy: How does it work. Annu Rev Biochem. 85, 685-713 (2016).
  14. Jahreiss, L., Menzies, F. M., Rubinsztein, D. C. The itinerary of autophagosomes: From peripheral formation to kiss-and-run fusion with lysosomes. Traffic. 9 (4), 574-587 (2008).
  15. Pu, J., Guardia, C. M., Keren-Kaplan, T., Bonifacino, J. S. Mechanisms and functions of lysosome positioning. J Cell Sci. 129 (23), 4329-4339 (2016).
  16. Tapia, D., et al. KDEL receptor regulates secretion by lysosome relocation- and autophagy-dependent modulation of lipid-droplet turnover. Nat Commun. 10 (1), 735 (2019).
  17. Ichimiya, T., et al. Autophagy and autophagy-related diseases: A review. Int J Mol Sci. 21 (23), 8974 (2020).
  18. Ciechanover, A. Proteolysis: From the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  19. Khaminets, A., et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature. 522 (7556), 354-358 (2015).
  20. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death Differ. 20 (1), 31-42 (2013).
  21. Koerver, L., et al. The ubiquitin-conjugating enzyme ube2ql1 coordinates lysophagy in response to endolysosomal damage. EMBO Rep. 20 (10), e48014 (2019).
  22. Deosaran, E., et al. NBR1 acts as an autophagy receptor for peroxisomes. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 939-952 (2013).
  23. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (3), 137-155 (2019).
  24. Xu, C., Fan, J. Links between autophagy and lipid droplet dynamics. J Exp Bot. 73 (9), 2848-2858 (2022).
  25. White, E. The role for autophagy in cancer. J Clin Invest. 125 (1), 42-46 (2015).
  26. Amaravadi, R. K., Kimmelman, A. C., Debnath, J. Targeting autophagy in cancer: Recent advances and future directions. Cancer Discov. 9 (9), 1167-1181 (2019).
  27. Levy, J., et al. Intestinal inhibition of ATG7 prevents tumour initiation through a microbiome-influenced immune response and suppresses tumour growth. Nat Cell Biol. 17 (8), 1062-1073 (2015).
  28. Trentesaux, C., et al. Essential role for autophagy protein ATG7 in the maintenance of intestinal stem cell integrity. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (20), 11136-11146 (2020).
  29. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (review). Oncol Lett. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  30. Martin-Perez, M., Urdiroz-Urricelqui, U., Bigas, C., Benitah, S. A. The role of lipids in cancer progression and metastasis. Cell Metab. 34 (11), 1675-1699 (2022).
  31. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9 (1), 18699 (2019).
  32. Danielli, M., Perne, L., Jarc Jovicic, E., Petan, T. Lipid droplets and polyunsaturated fatty acid trafficking: Balancing life and death. Front Cell Dev Biol. 11, 1104725 (2023).
  33. Butler, L. M., et al. Lipids and cancer: Emerging roles in pathogenesis, diagnosis and therapeutic intervention. Adv Drug Deliv Rev. 159, 245-293 (2020).
  34. Nagarajan, S. R., Butler, L. M., Hoy, A. J. The diversity and breadth of cancer cell fatty acid metabolism. Cancer Metab. 9 (1), 2 (2021).
  35. Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipids in cancer: A global view of the contribution of lipid pathways to metastatic formation and treatment resistance. Oncogenesis. 11 (1), 46 (2022).
  36. Yang, K., et al. The role of lipid metabolic reprogramming in tumor microenvironment. Theranostics. 13 (6), 1774-1808 (2023).
  37. Tan, Y., et al. Metabolic reprogramming from glycolysis to fatty acid uptake and beta-oxidation in platinum-resistant cancer cells. Nat Commun. 13 (1), 4554 (2022).
  38. Safi, R., Menendez, P., Pol, A. Lipid droplets provide metabolic flexibility for cancer progression. FEBS Lett. 598 (10), 1301-1327 (2024).
  39. Iwahashi, N., et al. Lipid droplet accumulation independently predicts poor clinical prognosis in high-grade serous ovarian carcinoma. Cancers (Basel). 13 (20), 5251 (2021).
  40. Luo, W., et al. Adding fuel to the fire: The lipid droplet and its associated proteins in cancer progression. Int J Biol Sci. 18 (16), 6020-6034 (2022).
  41. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using bodipy dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 133 (4), 477-480 (2010).
  42. Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: Regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Dev Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
  43. Nguyen, T. B., Olzmann, J. A. Lipid droplets and lipotoxicity during autophagy. Autophagy. 13 (11), 2002-2003 (2017).
  44. Giamogante, F., et al. A SPLICS reporter reveals-synuclein regulation of lysosome-mitochondria contacts which affects TFEB nuclear translocation. Nat Commun. 15 (1), 1516 (2024).
  45. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  46. Nguyen, T. B., et al. DGAT1-dependent lipid droplet biogenesis protects mitochondrial function during starvation-induced autophagy. Dev Cell. 42 (1), 9-21.e5 (2017).
  47. Murugan, S., Amaravadi, R. K. Methods for studying autophagy within the tumor microenvironment. Adv Exp Med Biol. 899, 145-166 (2016).
  48. Mallela, S. K., et al. Detection and quantification of lipid droplets in differentiated human podocytes. Methods Mol Biol. 1996, 199-206 (1996).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

LipofajiMakrootofajiLipid Damlac k KatabolizmasOtofagozomlarLizozomlarH cresel StresN rodejeneratif Hastal klarMetabolik BozukluklarKanserSerbest Ya AsitleriFosfolipid Tek TabakalMembran SenteziSinyal Molek lleriEnerji DengesiTerap tik Hedefler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır