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Resumen

La lipofagia es una forma selectiva de autofagia que implica la degradación de las gotas de lípidos. Las disfunciones en este proceso se asocian con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no se comprenden completamente. Este protocolo describe enfoques de imágenes cuantitativas para comprender mejor la interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer.

Resumen

La macroautofagia, comúnmente conocida como autofagia, es un proceso celular altamente conservado responsable de la degradación de los componentes celulares. Este proceso es particularmente prominente en condiciones como el ayuno, el estrés celular, el daño de los orgánulos, el daño celular o el envejecimiento de los componentes celulares. Durante la autofagia, un segmento del citoplasma está encerrado dentro de vesículas de doble membrana conocidas como autofagosomas, que luego se fusionan con los lisosomas. Después de esta fusión, el contenido de los autofagosomas sufre una degradación masiva no selectiva facilitada por los lisosomas. Sin embargo, la autofagia también exhibe una funcionalidad selectiva, dirigiéndose a orgánulos específicos, incluidas las mitocondrias, los peroxisomas, los lisosomas, los núcleos y las gotas de lípidos (LD). Las gotas de lípidos están encerradas por una monocapa de fosfolípidos que aísla los lípidos neutros del citoplasma, protegiendo a las células de los efectos nocivos del exceso de esteroles y ácidos grasos libres (FFA). La autofagia está implicada en diversas afecciones, como enfermedades neurodegenerativas, trastornos metabólicos y cáncer. Específicamente, la lipofagia, la degradación dependiente de la autofagia de las gotas de lípidos, desempeña un papel crucial en la regulación de los niveles intracelulares de FFA en diferentes estados metabólicos. Esta regulación apoya procesos esenciales como la síntesis de membranas, la formación de moléculas de señalización y el equilibrio de energía. En consecuencia, la lipofagia alterada aumenta la vulnerabilidad celular a los estímulos de muerte y contribuye al desarrollo de enfermedades como el cáncer. A pesar de su importancia, los mecanismos precisos que gobiernan el metabolismo de las gotas de lípidos regulados por la lipofagia en las células cancerosas siguen siendo poco conocidos. Este artículo tiene como objetivo describir los protocolos de adquisición de imágenes confocales y análisis de imágenes cuantitativas que permiten la investigación de la lipofagia asociada con cambios metabólicos en células cancerosas. Los resultados obtenidos a través de estos protocolos pueden arrojar luz sobre la intrincada interacción entre la autofagia, el metabolismo de los lípidos y la progresión del cáncer. Al dilucidar estos mecanismos, pueden surgir nuevas dianas terapéuticas para combatir el cáncer y otras enfermedades relacionadas con el metabolismo.

Introducción

La autofagia es un término general utilizado para describir los procesos catabólicos en los que la célula transporta sus componentes al lisosoma para su degradación. Hasta la fecha, se han identificado tres tipos de autofagia: microautofagia, macroautofagia y autofagia mediada por chaperonas 1,2,3. La macroautofagia, en lo sucesivo denominada autofagia, es una vía esencial para regular la homeostasis celular. La ruptura de este equilibrio puede conducir al desarrollo de condiciones patológicas4.

La autofagia es un proceso complejo que implica varios pasos. El primer paso es la inducción de la autofagia, desencadenada por diversos estímulos como la retirada de factores de crecimiento (insulina y factores de crecimiento similares a la insulina), infecciones patógenas, niveles reducidos de energía celular (ATP), estrés extracelular o intracelular (p. ej., hipoxia, estrés del retículo endoplásmico (RE), estrés oxidativo) y deficiencia de nutrientes (aminoácidos, glucosa)5. El segundo paso implica la formación del fagoforo, donde se inicia el aislamiento de la membrana del RE, la membrana plasmática y las mitocondrias. La formación de novo involucra maquinaria conservada de proteínas citosólicas que se reclutan secuencialmente6, como el complejo quinasa-1 similar a Ser/Thr Unc-51 (ULK1: ATG1 en levadura), Beclin-1 y VPS347. Después de la formación del complejo ULK1, el complejo I de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) de clase III es reclutado a la membrana aislada (IM), que funciona en el secuestro inicial de cargas8. Además, el complejo ULK1 tiene la capacidad de reclutar ATG9 a la membrana de aislamiento (IM), un paso esencial ya que las vesículas de ATG9 son reconocidas como portadoras de membrana que facilitan la expansión de IM9.

Dos sistemas de conjugación similares a la ubiquitina (Ubl) son críticos para el proceso de expansión: el sistema de cadena ligera 3 (LC3-I) asociado a microtúbulos y el sistema ATG1210. Antes de la conjugación, el precursor LC3 sufre una escisión. A continuación, la LC3-I citosólica se conjuga con la fosfatidiletanolamina (PE) para producir la LC3-PE asociada a la membrana (LC3-II), que facilita la formación de autofagosomas11. La carga debe internalizarse en el autofagosoma de doble membrana en formación durante este proceso. La autofagia puede internalizar objetivos aleatorios para su degradación o capturar cargas selectivas a través de receptores de autofagia específicos, como p62/SQSTM112. El último paso es la fusión del autofagosoma formado con los lisosomas, lo que conduce a la formación de autolisosomas. Aunque el mecanismo preciso para la formación de autolisosoma sigue siendo difícil de alcanzar, los complejos de anclaje de membrana, la proteína de unión a GTP relacionada con RAS y las proteínas receptoras de proteínas de unión al factor sensibles a la N-etilmaleimida soluble (SNARE) están involucradas en este proceso de fusión13. Además, el sistema de citoesqueletos de microtúbulos es esencial para el tráfico de autofagosomas y lisosomas maduros desde sitios de iniciación aleatorios hacia el área perinuclear para la formación de autolisosomas 14,15,16. En el autolisosoma, las cargas secuestradas aleatoria o selectivamente son degradadas proteolíticamente por las proteasas lisosomales17.

El proceso de autofagia se conserva en todos los organismos eucariotas y es crucial en la regulación de las condiciones intracelulares a través del recambio citoplasmático. Elimina las proteínas mal plegadas o agregadas, elimina los patógenos intracelulares y elimina los orgánulos dañados. Varios orgánulos, incluyendo el retículo endoplásmico, las mitocondrias, los peroxisomas, los lisosomas, el núcleo y los LDs, han sido reportados como objetivos de la autofagia 16,18,19,20,21,22. Las LD se originan en el RE y son orgánulos de almacenamiento esenciales para la homeostasis lipídica y energética. Su arquitectura distintiva consiste en un núcleo hidrofóbico de lípidos neutros encerrado por una monocapa de fosfolípidos incrustada con proteínas específicas. Estas gotitas pueden interactuar con varios orgánulos celulares a través de los sitios de contacto de la membrana23. Además, la autofagia ayuda a reciclar los recursos primarios para mantener las condiciones celulares óptimas. Por ejemplo, la degradación de las LD puede conducir a la producción de ATP a través de la β-oxidación de ácidos grasos24.

La autofagia se asocia con diversas enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas, los trastornos metabólicos y el cáncer17. La autofagia puede promover o inhibir el crecimiento tumoral en el cáncer, dependiendo del contexto25,26. Por ejemplo, los ratones Beclin 1 +/- exhiben una alta incidencia de linfomas espontáneos y carcinomas en órganos como el pulmón, el hígado y el tejido mamario. Por el contrario, la pérdida del gen Atg7 relacionado con la autofagia en las células epiteliales intestinales atenúa el crecimiento tumoral impulsado por la pérdida del supresor tumoral primario en el cáncer colorrectal, la poliposis adenomatosa coli (APC)27,28. Por lo tanto, la pérdida de genes relacionados con la autofagia puede tener efectos opuestos sobre el crecimiento tumoral.

Las células cancerosas deben producir energía para mantener su crecimiento, divisióny supervivencia. Tienen alta avidez por los lípidos, que se utilizan para la biosíntesis de componentes estructurales y la producción de energía30. Las células cancerosas pueden adaptar su metabolismo a las condiciones ambientales. Por ejemplo, cuando se suprime la glucólisis en las células HeLa derivadas del cáncer de cuello uterino, se incrementa la fosforilación oxidativa para obtener el ATP necesario para la supervivencia31. Los lípidos en una célula no existen como FFA no esterificados debido a su potencial citotoxicidad a altas concentraciones. En cambio, las células almacenan FFA y colesterol como biomoléculas neutras e inertes, como ésteres de esteroles y triglicéridos en LD32. En consecuencia, la lipofagia puede contribuir al metabolismo del cáncer al suministrar FFA para producir energía, un campo emergente en la investigación del cáncer. Sin embargo, las vías que regulan al alza la oxidación de los AG mitocondriales en las células cancerosas siguen siendo poco conocidas. Se ha demostrado que la absorción y acumulación de FFAs mejora la agresividad de diferentes tipos de cáncer 33,34,35. La reprogramación del metabolismo lipídico es un sello distintivo de la reprogramación metabólica del cáncer, desempeñando un papel fundamental como respuesta adaptativa para manejar escenarios fisiológicos adversos en el microambiente tumoral36,37. De hecho, la acumulación de LDs se ha observado en muchos cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón, mama y próstata, y se asocia con agresividad y mal pronóstico clínico 38,39,40.

Dada la relevancia de la autofagia y las LDs en el metabolismo del cáncer y los mecanismos poco conocidos, es fundamental establecer protocolos para estudiar su contribución al desarrollo del cáncer. Este estudio describe un protocolo para evaluar la lipofagia a través de la adquisición de imágenes confocales y protocolos de análisis de imágenes cuantitativas para investigar los cambios metabólicos de los lípidos en las células cancerosas.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo con células HeLa de adenocarcinoma epitelial (CCL2, ATCC). El protocolo se centra en el estudio de las gotas de lípidos (LD) durante la inducción de la lipofagia en células vivas para cuantificar el curso temporal de la variación del número de LD y las interacciones LD-autofagosoma en células que expresan el tipo salvaje (p62/SQSTM1-S182S) y dos mutantes específicos del receptor de autofagia p62/SQSTM116. La expresión de una forma fosfodefectuosa (p62/SQSTM1-S182A) aumenta el número de LDs, mientras que la expresión de una forma fosfo-imitadora (p62/SQSTM1-S182E) reduce el número de LDs16. En primer lugar, se describe un método para analizar las LD en células vivas mediante microscopía confocal. A continuación, se explica el protocolo para la adquisición y el análisis de imágenes imparciales y totalmente automatizados utilizando un microscopio confocal robotizado. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Obtención de imágenes confocales de células vivas

  1. Cultivo celular
    1. Cultivar las células a 37 °C y 5% de CO2 en el Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino (FBS), 1.000 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y anfotericina B. Mantener las células hasta que no alcancen más del 80% de confluencia.
    2. Lave las células con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato 1x, recoja con tripsina / EDTA al 0,25% v/v y centrifugue a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Deseche el sobrenadante con una pipeta.
    4. Vuelva a suspender las células en medio de cultivo DMEM con 10% v/v FBS y semilla (0,05 x 106 células/pocillo) en placas con fondo de vidrio de 35 mm.
    5. Transfecte las células utilizando la transfección TransIT-LT1 o el reactivo Lipofectamine 2000. Utilice 1 μg de ADN plásmido de cada variante de fosfoterapia p62/SQSTM1-mcherry y p62/SQSTM1-mcherry16 de tipo salvaje.
    6. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h antes de continuar con los tratamientos posteriores.
      NOTA: A las 16-24 h después de la transfección, p62/SQSTM1 forma condensados grandes en lugar de autofagosomas discretos de p62/SQSTM1. Estos grandes condensados se disipan en gran medida en la marca de 48 horas, lo que permite una observación más precisa de los autofagosomas.
  2. Etiquetado de orgánulos
    1. Lave las celdas en un plato con fondo de vidrio dos veces con 1x PBS (precalentado a 37 °C).
    2. Incubar las células con BODIPY 493/503 diluido a 0,5 μM en medio DMEM suplementado con 10 mM de HEPES y mantener durante 30 min a 37 °C, 5% de CO2. BODIPY 405 y BODIYPY 633 también se pueden utilizar con los mismos resultados.
    3. Comprobar que la expresión de las variantes p62/SQSTM1 induce cambios en el número de LDs y en la intensidad de la fluorescencia total.
    4. Lave las células con 1x PBS (temperatura ambiente) y manténgalas en DMEM sin fenol rojo complementado con un tampón HEPES de 10 mM calificado para ES para la obtención de imágenes de células vivas.
      NOTA: BODIPY 493/503 emite fluorescencia verde brillante, lo que lo hace conveniente para el etiquetado de doble fluorescencia. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, como la excitación repetida, puede emitir fluorescencia roja, lo que puede llevar a interpretaciones erróneas (falsa colocalización) cuando se combina con marcadores rojos. Para más información sobre los fluoróforos de excitación de 550 nm, consulte el artículo de Ohsaki et al.41.
  3. Adquisición de imágenes de microscopía confocal en imágenes de células vivas
    NOTA: Las imágenes de las LD se adquieren utilizando un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de 63x (N.A. 1.4). Se utilizó un software de adquisición de imágenes compatible para capturar las imágenes. La temperatura se mantiene a 37 °C mediante un sistema de control de temperatura automatizado.
    NOTA: Las imágenes de las gotas de lípidos (LD) se adquirieron utilizando un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de 63x (N.A. 1.4). Se utilizó un software de adquisición de imágenes compatible para capturar las imágenes. La temperatura se mantuvo a 37 °C mediante un sistema automatizado de control de temperatura.
    1. Ajuste el láser de gas argón multilínea al 10% de potencia de trabajo, con la línea láser de 488 nm con una potencia de trabajo del 1%-2%, lo que da como resultado una potencia láser general del 0,1%-0,2%.
    2. Para minimizar el daño celular y probar el fotoblanqueo, ajuste el láser de 568 nm a una potencia del 3% al 5%.
    3. Ajuste la configuración de adquisición de imágenes en el software a una resolución de 1024 x 1024 píxeles. El sistema utiliza un detector híbrido que funciona a 600 Hz, con un promedio de 2.
    4. Ajuste los rangos espectrales entre 478-494 nm (emisión verde para LD) y longitud de onda de 600-625 nm (emisión roja para mCherry).
    5. Ajuste el tamaño del orificio a 1 unidad Airy (AU) para una longitud de onda de 488 nm.
    6. Incubar las células con 8-Br-cAMP (100 mM) para activar la quinasa PKA y aumentar la degradación de LDs16.
    7. Captura imágenes fluorescentes a intervalos de 5 minutos, 37 °C durante 60 minutos.
  4. Análisis de imágenes
    1. Abra un archivo de pila que contenga secuencias individuales de imágenes en vivo mediante ImageJ. Utilice el administrador de ROI para la segmentación manual de celdas. Guarde las regiones para el siguiente paso.
    2. Abra el archivo de pila y recupere los pasajes guardados para cada imagen. Ajuste el umbral del canal LD.
    3. Mida la intensidad total de la fluorescencia seleccionando multimedida en el administrador de ROI.
      NOTA: Durante la autofagia, la intensidad de fluorescencia total y el número de LD pueden cambiar significativamente. Además, las interacciones entre los LD y los lisosomas aumentan durante la inducción de la autofagia.
  5. Análisis de contactos y colocalización
    1. Realice una captura multiespectral a intervalos de 1 s durante 5 min a 37 °C.
    2. Ajuste el láser de gas argón multilínea a una potencia del 10%, con la línea láser de 488 nm a una potencia de trabajo del 0,1% al 0,5% para minimizar el daño celular y el fotoblanqueo de la sonda. Ajuste el láser de 568 nm a una potencia del 3%-5%.
    3. Haga clic en ComDet V: Plugins < ComDet V 0.5.3 < detectar partículas. Defina la distancia mínima que deben tener los puntos para que se consideren colocalizados.
    4. Elija los parámetros que definen la partícula, como su tamaño (unidad de mm o píxeles) y el umbral, para ambos canales de forma independiente. Se proporcionará un resumen con el número de partículas en cada canal para cada tiempo y el porcentaje de colocalización correspondiente, que se puede exportar a Excel (ver Archivo Complementario 1).
      NOTA: El complemento ComDet V se recomienda para orgánulos con forma ovalada, como gotas de lípidos, endosomas, peroxisomas o lisosomas. No se recomienda la colocalización con orgánulos como las mitocondrias. El plugin "ComDet V" (distribución FIJI de ImageJ) permite analizar la colocalización temporal mediante el análisis de partículas. Para instalarlo en Fiyi, copie la URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/, vaya a Ayuda, Actualizar, seleccione Administrar sitios de actualización - Agregar sitio de actualización y pegue la URL. Aplique los cambios; Se recomienda utilizar dos canales. Si hay más canales, sepárelos y vuelva a unirlos mediante Combinar.
  6. Movimiento dinámico de los LD
    1. Defina las regiones de interés (ROI) para los cordones y las celdas y guárdelas. Ve a plugins y selecciona Tracking y TrackMate.
    2. Abre TrackMate. La primera ventana del plugin proporciona información sobre los intervalos de tiempo en los que se capturan las imágenes y la resolución de la imagen. Para confirmar intervalos de tiempo sin realizar cambios, haga clic en SIGUIENTE.
    3. Seleccione Detector LoG y, a continuación, SIGUIENTE. En la configuración del detector LoG, filtre las partículas según su diámetro, de 0,8 a 1,0 micras, y establezca un umbral adecuado. Realice una vista previa para confirmar los parámetros adecuados y haga clic en SIGUIENTE.
    4. Establezca el umbral inicial, un umbral de calidad que limita el número de puntos que se van a analizar. Esto es necesario cuando se siguen muchos puntos en el avión, lo cual es un desafío. No utilice el filtro; presione NEXT sin cambiar los parámetros.
    5. Seleccione una vista: elija HyperStack Displayer y haga clic en SIGUIENTE.
    6. Seleccione Rastreador LAP de movimiento lineal para partículas con velocidad constante en el plano.
    7. Defina la distancia máxima entre dos puntos al iniciar una nueva pista. Dependiendo de las imágenes, se sugiere que esté entre 0,5 -1 micra.
    8. Establezca la distancia máxima desde una posición predicha para los puntos candidatos para el análisis.
    9. Establezca Espacio máximo de fotogramas como el tiempo máximo para seguir un punto que puede desaparecer del plano focal. Recomendamos dos puntos de tiempo.
    10. Seleccione Opciones de visualización. La tabla resumen, que incluye la velocidad mínima, la velocidad máxima, la velocidad media, la velocidad media y el desplazamiento de la vía, se exporta a Excel (consulte el archivo complementario 2).
    11. Seleccione Trazar entidades. Para representar los resultados visualmente, vaya a Pistas. Seleccione la medida que desea representar (velocidad y desplazamiento) en el eje X y los puntos se colocarán en el eje Y.
    12. Seleccione una acción para guardar los vídeos que muestran el movimiento de las manchas. Esto permite la visualización de puntos que muestran cambios significativos.
      NOTA: La mejora de la autofagia optimiza el flujo celular y reduce el número de LD, destacando su papel crucial en la regulación metabólica y la homeostasis celular16. Los plugins mencionados están disponibles para el software ImageJ (distribución FIJI). También se puede utilizar un software equivalente. Para todas las mediciones de intensidad de fluorescencia, se utilizó la densidad de fluorescencia integrada ("RawIntDen" en ImageJ), que representa la fluorescencia total en cada píxel de la imagen, teniendo en cuenta el área.

2. Adquisición y análisis de imágenes confocales totalmente automatizados en celdas fijas

NOTA: Este método permite evaluar varias condiciones y desarrollar mediciones triplicadas para cada condición, mejorando la confianza en los valores medios medidos y permitiendo la determinación de la desviación estándar o el error estándar para la diferenciación estadística entre experimentos. El flujo de trabajo del método se muestra en el diagrama de flujo que se muestra en la figura 1.

  1. Cultivo celular
    1. Cultivo de las células a 37 °C y 5% de CO2 en el Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino (FBS), 1.000 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y anfotericina B.
    2. Lave las células con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x, recolectada con tripsina v/EDTA al 0,25% v/v.
    3. Recoja las células en un tubo de centrífuga de 15 ml.
    4. Centrifugar las celdas a temperatura ambiente a 100 x g durante 5 min.
    5. Aspire el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta y mantenga el pellet de celdas.
    6. Vuelva a suspender el pellet de células en un medio de cultivo DMEM con FBS al 10% v/v y siembre en placas de 96 pocillos de fondo óptico (0,05 x 106 células/pocillo).
      NOTA: Las células se incuban a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h antes de proceder con los tratamientos posteriores.
  2. Inducción de autofagia por inanición sérica
    1. Retirar el medio de cultivo celular e incubar las células en medio DMEM privado de suero para eliminar el suero e inducir la autofagia durante 6 h.
    2. Utilice bafilomycin A1 200 nM para inhibir la lipofagia LD. El inhibidor de la diacilglicerol aciltransferasa-1 (DGAT1) T863 (50 μM) inhibe la biogénesis de la LD. Utilice el inhibidor de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT1) Etomoxir (100 μM) para inhibir la conversión de los FFA a acil-carnitina. Además, la lipólisis puede inhibirse mediante el uso de ATGLstatin (10 μM).
  3. Fijación celular
    1. Lave las células tres veces con PBS-CM helado (200 μL/pocillo).
    2. Fijar las celdas con paraformaldehído al 4% diluido en PBS suplementado con 0,1 mM de CaCl2 y 1 mM de MgCl2 (PBS-CM) a temperatura ambiente durante 15 min16.
    3. Lavar las células tres veces con PBS-CM (200 μL/pocillo).
    4. Permeabilizar con Triton X-100 al 0,2% en PBS-CM a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Lave las células tres veces con PBS-CM.
  4. Etiquetado de orgánulos
    1. Incubar las células con BODIPY 493/503 diluido a 0,5 μM y DAPI (125 mg/mL) en PBS-MC durante 30 min a 37 °C.
    2. Lavar tres veces con PBS-CM.
    3. Mantenga las células fijadas y teñidas en 200 μL de PBS por pocillo hasta la adquisición de la imagen.
      NOTA: La placa de 96 pocillos puede almacenarse a 4 °C durante varias semanas, protegida de la luz y la deshidratación. No se requiere el montaje con medios de montaje antidecoloración de uso común.
  5. Microscopía confocal automatizada (células fijas)
    1. Realizar tinción de núcleos para la segmentación automatizada de imágenes16.
      NOTA: La adquisición de imágenes utiliza un microscopio de disco giratorio con un objetivo de inmersión en agua de 40x (N.A 1.1). La adquisición de DAPI se realiza utilizando iluminación LED de 305 nm (Ej: 355-385 nm; Em: 430-500 nm), y la adquisición BODIPY 493/503 se realiza utilizando iluminación LED de 488 nm (Ex: 460-490 nm; EM: 550-550 nm).
  6. Análisis de imágenes
    NOTA: El análisis de imagen16 se realiza utilizando un software compatible con un módulo de análisis LD dedicado. El software utilizado en este estudio (ver Tabla de Materiales) tiene una solución lista para usar (RMS Lipid Droplet Analysis) combinación de algoritmos para la segmentación y cuantificación de imágenes.
    1. Identifique los núcleos seleccionando el canal DAPI y ajuste el umbral en función de la señal y el fondo.
    2. Identificar el citoplasma. Seleccione el método apropiado en función del canal de fluorescencia LDs.
    3. Identifique los puntos ajustando los parámetros: Radio (1-1,5 μm), Contraste (0,2-0,25), Intensidad de punto a región sin corregir (0,4-0,6), Distancia (0,3-0,4 μm), Radio de pico de punto (0,2-0,25 μm).
    4. Calcular las propiedades de la morfología: seleccione LD de población, Punto de región y método estándar y, a continuación, seleccione Área.
    5. Calcular las propiedades de intensidad: seleccione el canal de LD , los LD de población, el punto de región y el método estándar .
    6. Calcular propiedades: seleccione la población de todas las celdas, seleccione el método por LD de población relacionadas y, a continuación, seleccione el número de LD, el área y la intensidad (media y suma; la suma es la densidad/intensidad de fluorescencia integrada). Esto producirá mediciones de LD relacionadas con la celda.
    7. Defina los resultados seleccionando Salida estándar, Recuento de objetos, Número de LD por celda expresado como media ± DE, LD promedio por área, LD totales por área, fracciones de LD por área e intensidad de LD totales.

Resultados

Obtención de imágenes confocales de células vivas
Las LD son dinámicas e interactúan transitoriamente con los autofagosomas p62/SQSTM1 positivos. Cuando se induce la lipofagia, estas interacciones disminuyen el número de LD y su intensidad fluorescente total. Este protocolo utilizó versiones fosfomutantes del receptor de autofagia p62/SQSTM1 para examinar estos efectos16.

El número y la intensidad de fluoresc...

Discusión

Las técnicas cuantitativas de imagen, como la microscopía confocal y los protocolos de análisis de imágenes, han proporcionado información valiosa sobre la dinámica de las LD durante la lipofagia 16,42,43. Estas tecnologías permiten la visualización y cuantificación en tiempo real de las LD, lo que permite analizar su número, tamaño e interacciones con otros orgánulos

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

El microscopio confocal robotizado Operetta fue financiado por el Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072 subvención. C.L. contó con el apoyo de la Vicerrectoría de Investigación y Doctorados (VRID), beca de doctorado de la Universidad San Sebastián. C.S. contó con el apoyo de la beca de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. y J.C. contaron con el apoyo del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

Referencias

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
  2. Mejlvang, J., et al. Starvation induces rapid degradation of selective autophagy receptors by endosomal microautophagy. J Cell Biol. 217 (10), 3640-3655 (2018).
  3. Kaushik, S., Cuervo, A. M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (6), 365-381 (2018).
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