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要約

脂肪食は、脂肪滴の分解を伴うオートファジーの選択的な形態です。このプロセスの機能不全は、がんの発症に関連しています。しかし、その正確なメカニズムはまだ完全には解明されていません。このプロトコルでは、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行の相互作用をよりよく理解するための定量的イメージングアプローチについて説明します。

要約

マクロオートファジーは、一般にオートファジーと呼ばれ、細胞成分の分解に関与する高度に保存された細胞プロセスです。このプロセスは、空腹時、細胞ストレス、オルガネラ損傷、細胞損傷、細胞成分の老化などの条件下で特に顕著です。オートファジーでは、細胞質の一部がオートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞に囲まれ、オートファゴソームがリソソームと融合します。この融合後、オートファゴソームの内容物は、リソソームによって促進される非選択的なバルク分解を受けます。しかし、オートファジーは、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム、核、脂質滴(LD)などの特定のオルガネラを標的とする選択的な機能も示します。脂肪滴は、細胞質から中性脂質を分離するリン脂質単層によって囲まれており、過剰なステロールや遊離脂肪酸(FFA)の有害な影響から細胞を保護します。オートファジーは、神経変性疾患、代謝障害、がんなど、さまざまな疾患に関与しています。具体的には、脂肪分(オートファジー依存的に脂肪滴を分解する)は、さまざまな代謝状態における細胞内FFAレベルの調節に重要な役割を果たします。この制御は、膜合成、シグナル伝達分子の形成、エネルギーバランスなどの重要なプロセスを支えています。その結果、脂肪食の障害は、死の刺激に対する細胞の脆弱性を高め、癌などの疾患の発症に寄与します。その重要性にもかかわらず、がん細胞の脂肪食によって制御される脂質飛沫代謝を支配する正確なメカニズムは、まだ十分に理解されていません。この記事では、がん細胞の代謝変化に関連する脂肪食の研究を可能にする共焦点イメージング取得および定量的イメージング解析プロトコルについて説明することを目的としています。これらのプロトコールを通じて得られた結果は、オートファジー、脂質代謝、およびがんの進行との間の複雑な相互作用に光を当てる可能性があります。これらのメカニズムを解明することで、がんをはじめとする代謝性疾患に対する新たな治療標的が出現する可能性があります。

概要

オートファジーとは、細胞がその成分をリソソームに輸送して分解する異化プロセスを表すために使用される一般的な用語です。現在までに、マイクロオートファジー、マクロオートファジー、シャペロン介在オートファジーの3種類のオートファジーが同定されています1,2,3。マクロオートファジー(以下、オートファジー)は、細胞の恒常性を調節するための必須経路です。このバランスの乱れは、病的状態の発症につながる可能性があります4。

オートファジーは、複数のステップを含む複雑なプロセスです。最初のステップはオートファジー誘導で、成長因子(インスリンおよびインスリン様成長因子)の離脱、病原性感染症、細胞エネルギーレベル(ATP)の低下、細胞外または細胞内ストレス(低酸素症、小胞体(ER)ストレス、酸化ストレスなど)、栄養欠乏(アミノ酸、グルコース)5.第2のステップは、ファゴフォアの形成に関係しており、ER、原形質膜、およびミトコンドリアから膜の分離が開始されます。de novo形成には、Ser/ThrキナーゼUnc-51様キナーゼ-1複合体(ULK1:酵母のATG1)、Beclin-1、VPS34など、逐次的に動員される細胞質タンパク質の保存機構が含まれます6。ULK1複合体の形成後、クラスIIIホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)複合体Iは、カーゴ8の初期隔離で機能する単離膜(IM)に動員されます。さらに、ULK1複合体は、ATG9を分離膜(IM)に動員する能力を有しており、これはATG9小胞がIMの増殖を促進する膜担体として認識されているため、重要なステップである9。

この増殖過程には、微小管関連タンパク質1軽鎖3(LC3-I)系とATG12系10という2つのユビキチン様(Ubl)標識系が重要です。標識に先立って、LC3前駆体は切断を受けます。次いで、細胞質LC3-Iをホスファチジルエタノールアミン(PE)に結合させて、膜結合LC3-PE(LC3-II)を産生し、オートファゴソーム形成を促進する11。このプロセスでは、貨物を形成中の二重膜オートファゴソームに取り込む必要があります。オートファジーは、分解のためのランダムなターゲットを内在化したり、p62/SQSTM112などの特定のオートファジー受容体を介して選択的なカーゴを捕捉することができます。最後のステップは、形成されたオートファゴソームとリソソームの融合であり、オートリソソームの形成につながります。オートリソソーム形成の正確なメカニズムは依然としてとらえどころのないままであるが、膜テザリング複合体、RAS関連GTP結合タンパク質、および可溶性-N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(SNARE)タンパク質がこの融合プロセスに関与している13。さらに、微小管細胞骨格系は、成熟したオートファゴソームおよびリソソームをランダムな開始部位から核周囲領域に向けて輸送し、オートリソソーム形成を行うために不可欠である14,15,16。オートリソソームでは、ランダムにまたは選択的に隔離されたカーゴは、リソソームプロテアーゼ17によってタンパク質分解的に分解される。

オートファジープロセスは、すべての真核生物にわたって保存されており、細胞質のターンオーバーを通じて細胞内状態を調節する上で重要です。誤って折りたたまれたタンパク質や凝集したタンパク質を除去し、細胞内病原体を排除し、損傷した細胞小器官を取り除きます。オートファジーの標的として、小胞体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム、核、LDなど、いくつかのオルガネラが報告されています16,18,19,20,21,22。LDはERに由来し、脂質とエネルギーの恒常性の中心となる重要な貯蔵オルガネラです。それらの異なる構造は、特定のタンパク質が埋め込まれたリン脂質単層に囲まれた中性脂質の疎水性コアで構成されています。これらの液滴は、膜接触部位23を通じて様々な細胞小器官と相互作用することができる。さらに、オートファジーは一次資源をリサイクルして最適な細胞状態を維持するのに役立ちます。例えば、LDの分解は、脂肪酸β酸化24を通じてATP産生につながる可能性がある。

オートファジーは、神経変性疾患、代謝障害、がんなど、さまざまな疾患と関連しています17。オートファジーは、状況に応じて、がんの腫瘍増殖を促進または阻害することができます25,26。例えば、Beclin 1 +/-マウスは、肺、肝臓、および乳腺組織などの臓器における自然リンパ腫および癌腫の発生率が高い。逆に、腸上皮細胞におけるオートファジー関連遺伝子Atg7の喪失は、結腸直腸癌における原発性腫瘍抑制因子である大腸腺腫性大腸菌(APC)の喪失によって引き起こされる腫瘍増殖を弱める27,28。したがって、オートファジー関連遺伝子の喪失は、腫瘍の成長に逆の影響を与える可能性があります。

がん細胞は、その成長、分裂、生存を維持するためにエネルギーを産生しなければならない29。それらは、構造成分の生合成およびエネルギー生産30に使用される脂質に対して高い結合力を有する。がん細胞は、環境条件に代謝を適応させることができます。例えば、子宮頸がん由来のHeLa細胞で解糖が抑制されると、酸化的リン酸化が増加して生存に必要なATPが得られる31。細胞内の脂質は、高濃度では細胞毒性が生じる可能性があるため、非エステル化FFAとしては存在しません。それどころか、細胞はFFAとコレステロールを、ステロールエステルやトリグリセリドなどの中性で不活性な生体分子としてLDに貯蔵する32。その結果、脂肪食は、がん研究の新たな分野であるFFAsにエネルギーを生成するためのFFAを供給することにより、がん代謝に貢献することができます。しかし、がん細胞におけるミトコンドリアFA酸化をアップレギュレートする経路は、まだ十分に解明されていません。FFAの取り込みと蓄積は、さまざまながんの種類の攻撃性を高めることが示されています33,34,35。脂質代謝リプログラミングは、がん代謝リプログラミングの特徴であり、腫瘍微小環境36,37における有害な生理学的シナリオを管理するための適応応答として極めて重要な役割を果たしている。実際、LDの蓄積は、肺がん、乳がん、および前立腺がんを含む多くのヒトのがんで観察されており、侵攻性と臨床予後不良と関連している38,39,40。

オートファジーとLDががん代謝に関連性を持ち、そのメカニズムが十分に理解されていないことを考えると、オートファジーががんの発生に寄与する研究のためのプロトコルを確立することが不可欠です。この研究では、がん細胞の脂質代謝変化を調査するための共焦点イメージング取得および定量的イメージング分析プロトコルを通じて脂肪食を評価するためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

本研究は、上皮性腺がんHeLa細胞(CCL2、ATCC)を用いて行われました。このプロトコルは、野生型 (p62/SQSTM1-S182S) とオートファジー受容体 p62/SQSTM1 の 2 つの部位特異的変異体を発現する細胞における LD 数変動と LD-オートファゴソーム相互作用の時間経過を定量化するために、生細胞での脂肪食誘導中の脂質滴 (LD) の研究に焦点を当てています16.リン酸化欠損型(p62/SQSTM1-S182A)の発現はLDの数を増加させ、リン酸化模倣型(p62/SQSTM1-S182E)の発現はLDの数を減少させる16。まず、共焦点顕微鏡を用いて生細胞中のLDを解析する方法について述べる。次に、偏りのない全自動画像取得と解析のプロトコルを、ロボット化された共焦点顕微鏡を使用して説明します。この研究で使用した試薬と機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 共焦点ライブセルイメージング

  1. 細胞培養
    1. 10% v/v ウシ胎児血清(FBS)、1,000 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、およびアムホテリシン B を添加した Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) で 37 °C および 5% CO2 で細胞を培養します。
    2. 1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、0.25% v/vトリプシン/EDTAを使用して回収し、室温で100 x g で5分間遠心分離します。
    3. ピペットを使用して上清を捨てます。
    4. 10% v/v FBSを含むDMEM培養培地に細胞を再懸濁し、(0.05 x 106 細胞/ウェル)を35 mmガラス底ディッシュに播種します。
    5. TransIT-LT1トランスフェクションまたはLipofectamine 2000試薬を使用して細胞をトランスフェクションします。各p62/SQSTM1-mcherryリン酸化バリアントおよび野生型p62/SQSTM1-mcherry16のプラスミドDNAを1 μg使用します。
    6. 細胞を37°Cおよび5%CO2 で48時間インキュベートしてから、その後の処理に進みます。
      注:トランスフェクション後16-24時間で、p62/SQSTM1は、離散的なp62/SQSTM1オートファゴソームではなく、大きな縮合体を形成します。これらの大きな凝縮物は、48時間マークまでに大部分が消散するため、オートファゴソームをより正確に観察できます。
  2. オルガネララベリング
    1. ガラス底皿で細胞を1x PBS(37°Cに予熱)で2回洗浄します。
    2. 10 mM HEPESを添加したDMEM培地で0.5 μMに希釈したBODIPY 493/503で細胞をインキュベートし、37°C、5%CO2で30分間保持します。BODIPY 405とBODIYPY 633も同じ結果で使用できます。
    3. p62/SQSTM1バリアントの発現により、LD数と総蛍光強度が変化することを確認します。
    4. 細胞を1x PBS(室温)で洗浄し、生細胞イメージング用の10 mM ES認定HEPESバッファーを添加したレッドフェノールフリーのDMEMで細胞を維持します。
      注:BODIPY 493/503は明るい緑色の蛍光を発するため、二重蛍光標識に便利です。しかし、繰り返しの励起などの特定の条件下では、赤色の蛍光を発することがあり、赤色のマーカーと組み合わせたときに誤った解釈(誤った共局在化)につながる可能性があります。550 nmの励起蛍光色素の詳細については、Ohsaki et al.41の論文を参照してください。
  3. ライブセルイメージングにおける共焦点顕微鏡画像取得
    注:LDの画像は、63倍油浸対物レンズ(N.A. 1.4)を備えた共焦点顕微鏡を使用して取得されます。互換性のある画像取得ソフトウェアを使用して画像をキャプチャしました。自動温度制御システムにより、温度は37°Cに保たれます。
    注:脂肪滴(LD)の画像は、63倍油浸対物レンズ(N.A.1.4)を備えた共焦点顕微鏡を使用して取得されました。互換性のある画像取得ソフトウェアを使用して画像をキャプチャしました。温度は自動温度制御システムを使用して37°Cに維持されました。
    1. マルチラインアルゴンガスレーザーを10%の作動力に調整し、488nmのレーザーラインを1%〜2%の作動力で、全体のレーザー出力は0.1%〜0.2%になります。
    2. 細胞の損傷とプローブの光退色を最小限に抑えるには、568 nmレーザーを3%〜5%の効力に調整します。
    3. ソフトウェアの画像取得設定を1024 x 1024ピクセルの解像度に調整します。このシステムは、600Hz(平均2)で動作するハイブリッド検出器を使用します。
    4. スペクトル範囲を478〜494 nm(LDの場合は緑色発光)から600〜625 nmの波長(mCherryの場合は赤色発光)の間で調整します。
    5. ピンホールのサイズを1 Aeroy Unit(AU)に調整し、波長は488nmです。
    6. 細胞を8-Br-cAMP(100 mM)でインキュベートして、PKAキナーゼを活性化し、LDの分解を増加させます16。
    7. 蛍光画像を5分間隔で、37°Cで60分間撮影します。
  4. 画像解析
    1. ImageJ を使用して、個々のライブ画像シーケンスを含むスタックファイルを開きます。ROI Managerを使用して、手動でのセルセグメンテーションを行います。次の手順のために領域を保存します。
    2. スタックファイルを開き、各画像に保存された領域を呼び出します。LD チャネルのしきい値を調整します。
    3. ROIマネージャーで マルチメジャー を選択して、総蛍光強度を測定します。
      注:オートファジー中、総蛍光強度とLDの数は大きく変化する可能性があります。さらに、LDとリソソームとの間の相互作用は、オートファジー誘導中に増加します。
  5. 連絡先と共局在分析
    1. 1秒間隔で5分間、37°Cでマルチスペクトルキャプチャを実行します。
    2. マルチラインアルゴンガスレーザーを10%の効力に設定し、488nmレーザーラインを0.1%〜0.5%の作動力にして、セルの損傷とプローブの光退色を最小限に抑えます。568nmレーザーを3%〜5%の効力に調整します。
    3. ComDet V:Plugins。ポイントが共局在であると見なされるために必要な最小距離を定義します。
    4. パーティクルを定義するパラメータ(サイズ(mmまたはピクセル単位)やしきい値など)を、両方のチャネルで個別に選択します。各時間における各チャンネルのパーティクル数と、Excelにエクスポートできる対応する共局在化率を含むサマリーが提供されます( 補足ファイル1を参照)。
      注:ComDet Vプラグインは、脂肪滴、エンドソーム、ペルオキシソーム、リソソームなどの楕円形のオルガネラに推奨されます。ミトコンドリアのようなオルガネラとの共局在にはお勧めできません。「ComDet V」プラグイン(ImageJ FIJI distribution)は、粒子解析を通じて時間的共局在を解析することができます。フィジーにインストールするには、URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ をコピーし、[ヘルプ]、[更新]に移動し、[更新サイトの管理]-[更新サイトの追加 ]を選択してURLを貼り付けます。変更を適用します。2つのチャネルを使用することをお勧めします。チャネルがさらにある場合は、チャネルを分離し、マージを使用して再結合します。
  6. LDのダイナミックな動き
    1. ビーズとセルの関心領域(ROI)を定義し、保存します。プラグインに移動し、 Tracking と TrackMateを選択します。
    2. TrackMate を開きます。プラグインの最初のウィンドウには、画像がキャプチャされる時間間隔と画像の解像度に関する情報が表示されます。変更を加えずに時間間隔を確認するには、[次へ]をクリックします。
    3. 「LoG 検出器」を選択し、「次へ」を選択します。LoG検出器構成では、粒子を0.8〜1.0ミクロンの直径に従ってフィルタリングし、適切なしきい値を設定します。プレビューを実行して適切なパラメータを確認し、[次へ]をクリックします。
    4. 分析するスポットの数を制限する品質のしきい値である初期しきい値を設定します。これは、飛行機上の多くのスポットを追うときに必要であり、これは困難です。フィルターは使用しないでください。パラメータを変更せずに NEXT を押します。
    5. ビューの選択: HyperStack Displayer を選択し、[ 次へ]をクリックします。
    6. 平面内で一定の速度を持つパーティクルの Linear motion LAP トラッカー を選択します。
    7. 新しいトラックを開始するときの 2 つのスポット間の最大距離を定義します。画像にもよりますが、0.5〜1ミクロンの間であることをお勧めします。
    8. 分析の候補スポットの予測位置からの最大距離を設定します。
    9. [Max Frame Gap] を、焦点面から消える可能性のあるスポットを追う最大時間として設定します。2つの時点をお勧めします。
    10. [ディスプレイ オプション] を選択します。最小速度、最大速度、平均速度、中央値、トラック変位を含むサマリー テーブルが Excel にエクスポートされます (補足ファイル 2 を参照)。
    11. プロット機能を選択します。結果を視覚的に表示するには、[トラック] に移動します。X軸で表すメジャー(速度と変位)を選択し、Y軸にスポットが配置されます。
    12. アクションを選択すると、スポットの動きを示すビデオが保存されます。これにより、大きな変化が見られるスポットを可視化することができます。
      注:オートファジーを強化すると、細胞フラックスが最適化され、LD数が減少し、代謝調節と細胞恒常性におけるその重要な役割が強調されます16。記載されているプラグインは、ImageJソフトウェア(FIJIディストリビューション)で使用できます。同等のソフトウェアも使用できます。すべての蛍光強度測定では、面積を考慮して各画像ピクセル全体の総蛍光を説明する積分蛍光密度(ImageJの「RawIntDen」)を使用しました。

2. 固定細胞における全自動共焦点画像取得と画像解析

注:この方法では、いくつかの条件を評価し、各条件に対して3倍の測定を行うことができるため、平均測定値の信頼性が向上し、実験間の統計的微分のための標準偏差または標準誤差の決定が可能になります。この分析法のワークフローは、 図 1 に示すフローチャートに示されています。

  1. 細胞培養
    1. 細胞を37°C、5%CO2 でDulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)で培養し、10% v/vウシ胎児血清(FBS)、1,000 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、およびアムホテリシンBを添加します。
    2. 0.25% v/v トリプシン/EDTAを使用して採取した1 mLの1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。
    3. 細胞を15 mLの遠心チューブに集めます。
    4. 細胞を室温で100 x g で5分間遠心分離します。
    5. ピペットで上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを保持します。
    6. 細胞ペレットを10% v/v FBSを含むDMEM培養培地に再懸濁し、光学ボトム96ウェルプレート(0.05 x 106 細胞/ウェル)に播種します。
      注:細胞を37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートしてから、その後の処理に進みます。
  2. 血清飢餓によるオートファジー誘導
    1. 細胞培養培地を取り出し、血清欠乏DMEM培地で細胞をインキュベートして血清を除去し、オートファジーを6時間誘導します。
    2. バフィロマイシンA1 200 nMを使用してLD脂肪食を阻害します。.ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ-1(DGAT1)阻害剤T863(50μM)はLD生合成を阻害します。カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT1)阻害剤エトモキシル(100μM)を使用して、FFAのアシルカルニチンへの変換を阻害します。.さらに、ATGLstatin(10μM)を使用することで脂肪分解を阻害することができます。
  3. 細胞固定
    1. 細胞を氷冷したPBS-CM(200 μL/well)で3回洗浄します。
    2. 0.1 mM CaCl2 および1 mM MgCl2 (PBS-CM)を添加したPBSで希釈した4%パラホルムアルデヒドで細胞を室温15分間16分間固定します。
    3. PBS-CM(200μL/ウェル)で細胞を3回洗浄します。
    4. 0.2% Triton X-100 in PBS-CM を室温で 15 分間透過処理します。
    5. PBS-CMで細胞を3回洗浄します。
  4. オルガネララベリング
    1. BODIPY 493/503を0.5 μMで希釈し、DAPI(125 mg/mL)をPBS-CMで37 °Cで30分間インキュベートします。
    2. PBS-CMで3回洗ってください。
    3. 固定して染色した細胞を、画像取得までウェルあたり200 μLのPBSに保ちます。
      注:96ウェルプレートは、光や脱水から保護され、4°Cで数週間保存できます。一般的に使用される色あせ防止封入剤による封止は必要ありません。
  5. 全自動共焦点顕微鏡(固定細胞)
    1. 自動画像セグメンテーションのための核染色の実施16。
      注:画像取得には、40倍(N.A 1.1)の水浸対物レンズを備えたスピニングディスク顕微鏡を使用します。DAPIの取得は、305 nm LED照明(例:355-385 nm;Em:430-500 nm)、およびBODIPY 493/503の取得は、488 nmのLED照明(例:460-490 nm;Em:550-550 nm)。
  6. 画像解析
    (注)画像解析16 は、専用のLD解析モジュールと互換性のあるソフトウェアを用いて行う。この研究で使用したソフトウェア( 材料表を参照)には、画像のセグメンテーションと定量化のための既製のソリューション(RMS Lipid Droplet Analysis)アルゴリズムの組み合わせがあります。
    1. DAPIチャネルを選択して核を特定し、信号とバックグラウンドに基づいてしきい値を調整します。
    2. 細胞質を特定します。LDの蛍光チャネルに基づいて適切な方法を選択します。
    3. 半径(1-1.5 μm)、コントラスト(0.2-0.25)、未補正スポットから領域への強度(0.4-0.6)、距離(0.3-0.4 μm)、スポットピーク半径(0.2-0.25 μm)のパラメータを調整してスポットを特定します。
    4. 形態特性の計算: 母集団LD、地域スポット、 および標準 方法を選択し、 次に地域を選択します。
    5. 強度プロパティの計算: LDチャンネル 、 母集団LD、リージョンスポット、 および標準 方法を選択します。
    6. プロパティの計算:すべての細胞の母集団を選択し、関連する母集団LDによる方法を選択し、LDの数、面積、および強度(平均と合計、合計は統合された蛍光密度/強度)を選択します。これにより、細胞に関連するLD測定値が得られます。
    7. 結果を定義するには 、標準出力、オブジェクト数、 平均 ± SD で表されるセルあたりの LD の数、 面積あたりの平均 LD、面積あたりの合計 LD、面積あたりの LD の割合、 および 合計 LD 強度を選択します。

結果

共焦点ライブセルイメージング
LDは動的であり、p62/SQSTM1陽性オートファゴソームと一過性に相互作用します。脂肪食が誘発されると、これらの相互作用によりLDの数とそれらの総蛍光強度が減少します。このプロトコルでは、オートファジー受容体p62/SQSTM1のリン酸化変異体を用いて、これらの影響を調べた16。

LD...

ディスカッション

共焦点顕微鏡法や画像解析プロトコルなどの定量的イメージング技術は、脂肪食16,42,43中のLDのダイナミクスに関する貴重な洞察を提供してきました。これらの技術により、LDのリアルタイムの可視化と定量が可能になり、LDの数、サイズ、および他のオルガネラとの相互作用の分析が可能になりま...

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

オペレッタのロボット共焦点顕微鏡は、Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072助成金によって資金提供されました。C.L.は、サンセバスチャン大学の博士課程奨学金であるVicerrectoria de Investigación y Doctorados(VRID)の支援を受けました。C.S.は、Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo(ANID)奨学金の支援を受けました。D.T.とJ.C.は、Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico(FONDECYT)N°1221374助成金の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

参考文献

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