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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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Résumé

La lipophagie est une forme sélective d’autophagie qui implique la dégradation des gouttelettes lipidiques. Les dysfonctionnements dans ce processus sont associés au développement du cancer. Cependant, les mécanismes précis ne sont pas encore entièrement compris. Ce protocole décrit des approches d’imagerie quantitative pour mieux comprendre l’interaction entre l’autophagie, le métabolisme des lipides et la progression du cancer.

Résumé

La macroautophagie, communément appelée autophagie, est un processus cellulaire hautement conservé responsable de la dégradation des composants cellulaires. Ce processus est particulièrement important dans des conditions telles que le jeûne, le stress cellulaire, les lésions organitaires, les dommages cellulaires ou le vieillissement des composants cellulaires. Au cours de l’autophagie, un segment du cytoplasme est enfermé dans des vésicules à double membrane appelées autophagosomes, qui fusionnent ensuite avec les lysosomes. Suite à cette fusion, le contenu des autophagosomes subit une dégradation massive non sélective facilitée par les lysosomes. Cependant, l’autophagie présente également une fonctionnalité sélective, ciblant des organites spécifiques, notamment les mitochondries, les peroxysomes, les lysosomes, les noyaux et les gouttelettes lipidiques (LD). Les gouttelettes lipidiques sont enfermées dans une monocouche de phospholipides qui isole les lipides neutres du cytoplasme, protégeant ainsi les cellules des effets néfastes de l’excès de stérols et d’acides gras libres (AGL). L’autophagie est impliquée dans diverses affections, notamment les maladies neurodégénératives, les troubles métaboliques et le cancer. Plus précisément, la lipophagie - la dégradation dépendante de l’autophagie des gouttelettes lipidiques - joue un rôle crucial dans la régulation des niveaux intracellulaires d’AGL dans différents états métaboliques. Cette régulation soutient des processus essentiels tels que la synthèse membranaire, la formation de molécules de signalisation et l’équilibre énergétique. Par conséquent, une lipophagie altérée augmente la vulnérabilité cellulaire aux stimuli de mort et contribue au développement de maladies telles que le cancer. Malgré son importance, les mécanismes précis régissant le métabolisme des gouttelettes lipidiques régulées par la lipophagie dans les cellules cancéreuses restent mal compris. Cet article vise à décrire les protocoles d’acquisition d’imagerie confocale et d’analyse d’imagerie quantitative qui permettent d’étudier la lipophagie associée aux changements métaboliques dans les cellules cancéreuses. Les résultats obtenus grâce à ces protocoles pourraient mettre en lumière l’interaction complexe entre l’autophagie, le métabolisme des lipides et la progression du cancer. En élucidant ces mécanismes, de nouvelles cibles thérapeutiques peuvent émerger pour lutter contre le cancer et d’autres maladies liées au métabolisme.

Introduction

L’autophagie est un terme général utilisé pour décrire les processus cataboliques dans lesquels la cellule transporte ses composants vers le lysosome pour la dégradation. À ce jour, trois types d’autophagie ont été identifiés : la microautophagie, la macroautophagie et l’autophagie médiée par un chaperon 1,2,3. La macroautophagie, ci-après appelée autophagie, est une voie essentielle pour réguler l’homéostasie cellulaire. La perturbation de cet équilibre peut conduire au développement de conditions pathologiques4.

L’autophagie est un processus complexe qui comporte plusieurs étapes. La première étape est l’induction de l’autophagie, déclenchée par divers stimuli tels que le retrait des facteurs de croissance (insuline et facteurs de croissance analogues à l’insuline), les infections pathogènes, la réduction des niveaux d’énergie cellulaire (ATP), le stress extracellulaire ou intracellulaire (par exemple, l’hypoxie, le stress du réticulum endoplasmique (RE), le stress oxydatif) et la carence en nutriments (acides aminés, glucose)5. La deuxième étape implique la formation du phagophore, où l’isolement membranaire est initié à partir du RE, de la membrane plasmique et des mitochondries. La formation de novo implique une machinerie conservée de protéines cytosoliques qui sont recrutées séquentiellement6, telles que le complexe kinase Ser/Thr Unc-51-like kinase-1 (ULK1 : ATG1 chez la levure), Beclin-1 et VPS347. Après la formation du complexe ULK1, le complexe phosphatidylinositol 3-kinase I de classe III (PI3K) est recruté dans la membrane isolée (IM), qui fonctionne dans la séquestration initiale des cargaisons8. De plus, le complexe ULK1 a la capacité de recruter ATG9 dans la membrane d’isolement (IM), une étape essentielle puisque les vésicules ATG9 sont reconnues comme des porteurs membranaires qui facilitent l’expansion de l’IM9.

Deux systèmes de conjugaison de type ubiquitine (Ubl) sont essentiels pour le processus d’expansion : le système LC3-I (protéine 1 de la chaîne légère 3 associée aux microtubules) et le système ATG1210. Avant la conjugaison, le précurseur LC3 subit un clivage. La LC3-I cytosolique est ensuite conjuguée à la phosphatidyléthanolamine (PE) pour produire la LC3-PE associée à la membrane (LC3-II), ce qui facilite la formation des autophagosomes11. La cargaison doit être internalisée dans l’autophagosome à double membrane en formation au cours de ce processus. L’autophagie peut internaliser des cibles aléatoires pour la dégradation ou capturer des cargaisons sélectives par le biais de récepteurs d’autophagie spécifiques tels que p62/SQSTM112. La dernière étape est la fusion de l’autophagosome formé avec les lysosomes, conduisant à la formation d’autolysosomes. Bien que le mécanisme précis de formation des autolysosomes reste insaisissable, les complexes d’attache membranaire, la protéine de liaison au GTP liée à RAS et les protéines SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein) sont impliquées dans ce processus de fusion13. De plus, le système du cytosquelette des microtubules est essentiel pour le trafic des autophagosomes et des lysosomes matures à partir de sites d’initiation aléatoires vers la zone périnucléaire pour la formation d’autolysosomes 14,15,16. Dans l’autolysosome, les cargaisons séquestrées de manière aléatoire ou sélective sont dégradées protéolytiquement par les protéases lysosomales17.

Le processus d’autophagie est conservé chez tous les organismes eucaryotes et est crucial dans la régulation des conditions intracellulaires par le renouvellement cytoplasmique. Il élimine les protéines mal repliées ou agrégées, élimine les agents pathogènes intracellulaires et élimine les organites endommagés. Plusieurs organites, dont le réticulum endoplasmique, les mitochondries, les peroxysomes, les lysosomes, le noyau et les LD, ont été signalés comme cibles de l’autophagie 16,18,19,20,21,22. Les LD proviennent du RE et sont des organites de stockage essentiels à l’homéostasie lipidique et énergétique. Leur architecture distincte consiste en un noyau hydrophobe de lipides neutres entouré d’une monocouche de phospholipides intégrée à des protéines spécifiques. Ces gouttelettes peuvent interagir avec divers organites cellulaires par le biais de sites de contact membranaire23. De plus, l’autophagie aide à recycler les ressources primaires pour maintenir des conditions cellulaires optimales. Par exemple, la dégradation des LD peut conduire à la production d’ATP par β-oxydation des acides gras24.

L’autophagie est associée à diverses maladies, notamment les maladies neurodégénératives, les troubles métaboliques et le cancer17. L’autophagie peut favoriser ou inhiber la croissance tumorale dans le cancer, selon le contexte25,26. Par exemple, les souris Beclin 1 +/- présentent une incidence élevée de lymphomes et de carcinomes spontanés dans des organes tels que le poumon, le foie et le tissu mammaire. À l’inverse, la perte du gène Atg7 lié à l’autophagie dans les cellules épithéliales intestinales atténue la croissance tumorale due à la perte du suppresseur de tumeur primaire dans le cancer colorectal, la polypose adénomateuse colique (APC)27,28. Ainsi, la perte de gènes liés à l’autophagie peut avoir des effets opposés sur la croissance tumorale.

Les cellules cancéreuses doivent produire de l’énergie pour soutenir leur croissance, leur division et leur survie29. Ils ont une grande avidité pour les lipides, qui sont utilisés pour la biosynthèse des composants structurels et la production d’énergie30. Les cellules cancéreuses peuvent adapter leur métabolisme aux conditions environnementales. Par exemple, lorsque la glycolyse est supprimée dans les cellules HeLa dérivées du cancer du col de l’utérus, la phosphorylation oxydative est augmentée pour obtenir l’ATP nécessaire à la survie31. Les lipides d’une cellule n’existent pas sous forme d’AGL non estérifiés en raison de leur cytotoxicité potentielle à des concentrations élevées. Au lieu de cela, les cellules stockent les AGL et le cholestérol sous forme de biomolécules neutres et inertes telles que les esters de stérols et les triglycérides dans les DL32. Par conséquent, la lipophagie peut contribuer au métabolisme du cancer en fournissant des AGL pour produire de l’énergie, un domaine émergent dans la recherche sur le cancer. Cependant, les voies qui régulent à la hausse l’oxydation de l’AF mitochondriale dans les cellules cancéreuses restent mal comprises. Il a été démontré que l’absorption et l’accumulation d’AGL améliorent l’agressivité de différents types de cancer 33,34,35. La reprogrammation du métabolisme des lipides est une caractéristique de la reprogrammation métabolique du cancer, jouant un rôle central en tant que réponse adaptative pour gérer les scénarios physiologiques défavorables dans le microenvironnement tumoral36,37. En effet, l’accumulation de LD a été observée dans de nombreux cancers humains, y compris les cancers du poumon, du sein et de la prostate, et est associée à l’agressivité et à un mauvais pronostic clinique 38,39,40.

Compte tenu de l’importance de l’autophagie et des ML dans le métabolisme du cancer et des mécanismes mal compris, il est essentiel d’établir des protocoles pour étudier leur contribution au développement du cancer. Cette étude décrit un protocole d’évaluation de la lipophagie par acquisition d’imagerie confocale et des protocoles d’analyse d’imagerie quantitative pour étudier les changements métaboliques lipidiques dans les cellules cancéreuses.

Protocole

Cette étude a été menée à l’aide de cellules HeLa d’adénocarcinome épithélial (CCL2, ATCC). Le protocole se concentre sur l’étude des gouttelettes lipidiques (LD) pendant l’induction de la lipophagie dans les cellules vivantes afin de quantifier l’évolution temporelle de la variation du nombre de LD et les interactions LD-autophagosome dans les cellules exprimant le type sauvage (p62/SQSTM1-S182S) et deux mutants spécifiques du récepteur de l’autophagie p62/SQSTM116. L’expression d’une forme phospho-défectueuse (p62/SQSTM1-S182A) augmente le nombre de LDs, tandis que l’expression d’une forme phospho-mimante (p62/SQSTM1-S182E) réduit le nombre de LDs16. Tout d’abord, une méthode d’analyse des LD dans des cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale est décrite. Ensuite, le protocole d’acquisition et d’analyse d’images impartiales et entièrement automatisées est expliqué à l’aide d’un microscope confocal robotisé. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Imagerie confocale de cellules vivantes

  1. Culture cellulaire
    1. Cultivez les cellules à 37 °C et à 5 % de CO2 dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % v/v de sérum fœtal bovin (FBS), 1 000 U/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et de l’amphotéricine B. Maintenez les cellules jusqu’à ce qu’elles n’atteignent pas plus de 80 % de confluence.
    2. Lavez les cellules avec 1 mL de solution saline tamponnée 1x phosphate, prélevez avec 0,25 % v/v trypsine/EDTA, et centrifugez à 100 x g pendant 5 min à température ambiante.
    3. Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette.
    4. Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture DMEM avec 10 % v/v FBS et les graines (0,05 x 106 cellules/puits) dans des boîtes à fond de verre de 35 mm.
    5. Transfectez les cellules à l’aide de la transfection TransIT-LT1 ou du réactif Lipofectamine 2000. Utilisez 1 μg d’ADN plasmidique de chaque phospho-variant p62/SQSTM1-mcherry et de type sauvage p62/SQSTM1-mcherry16.
    6. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 48 h avant de procéder aux traitements ultérieurs.
      REMARQUE : De 16 à 24 h après la transfection, p62/SQSTM1 forme de gros condensats plutôt que des autophagosomes discrets de p62/SQSTM1. Ces gros condensats se dissipent en grande partie au bout de 48 heures, ce qui permet une observation plus précise des autophagosomes.
  2. Étiquetage des organites
    1. Lavez les cellules dans un plat à fond de verre deux fois avec 1x PBS (préchauffé à 37 °C).
    2. Incuber les cellules avec BODIPY 493/503 dilué à 0,5 μM dans un milieu DMEM complété par 10 mM d’HEPES et conserver pendant 30 min à 37 °C, 5 % CO2. BODIPY 405 et BODIYPY 633 peuvent également être utilisés avec les mêmes résultats.
    3. Vérifiez que l’expression des variants p62/SQSTM1 induit des changements dans le nombre de LDs et l’intensité totale de la fluorescence.
    4. Lavez les cellules avec 1x PBS (température ambiante) et maintenez-les dans du DMEM sans phénol rouge complété par un tampon HEPES qualifié ES de 10 mM pour l’imagerie de cellules vivantes.
      REMARQUE : BODIPY 493/503 émet une fluorescence vert vif, ce qui le rend pratique pour le marquage à double fluorescence. Cependant, dans certaines conditions, telles qu’une excitation répétée, il peut émettre une fluorescence rouge, conduisant potentiellement à des interprétations erronées (fausse colocalisation) lorsqu’il est combiné avec des marqueurs rouges. Pour plus d’informations sur les fluorophores d’excitation de 550 nm, reportez-vous à l’article d’Ohsaki et al.41.
  3. Acquisition d’images par microscopie confocale en imagerie de cellules vivantes
    REMARQUE : Les images des LD sont acquises à l’aide d’un microscope confocal doté d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x (N.A. 1.4). Un logiciel d’acquisition d’images compatible a été utilisé pour capturer les images. La température est maintenue à 37 °C à l’aide d’un système de contrôle automatisé de la température.
    REMARQUE : Les images de gouttelettes lipidiques (LD) ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal doté d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x (N.A. 1.4). Un logiciel d’acquisition d’images compatible a été utilisé pour capturer les images. La température a été maintenue à 37 °C à l’aide d’un système de contrôle automatisé de la température.
    1. Ajustez le laser à gaz argon multiligne à 10 % de puissance de travail, avec la ligne laser 488 nm à 1 % à 2 % de puissance de travail, ce qui donne une puissance laser globale de 0,1 % à 0,2 %.
    2. Pour minimiser les dommages cellulaires et le photoblanchiment de la sonde, réglez le laser 568 nm à une puissance de 3 % à 5 %.
    3. Ajustez les paramètres d’acquisition d’images dans le logiciel à une résolution de 1024 x 1024 pixels. Le système utilise un détecteur hybride fonctionnant à 600 Hz, avec une moyenne de 2.
    4. Ajustez les plages spectrales entre 478-494 nm (émission verte pour les LD) et 600-625 nm de longueur d’onde (émission rouge pour mCherry).
    5. Ajustez la taille du sténopé à 1 unité Airy (AU) pour une longueur d’onde de 488 nm.
    6. Incuber les cellules avec du 8-Br-cAMP (100 mM) pour activer la PKA kinase et augmenter la dégradation des LDs16.
    7. Capturez des images fluorescentes à 5 minutes d’intervalle, à 37 °C pendant 60 min.
  4. Analyse d’images
    1. Ouvrez un fichier de pile contenant des séquences d’images en direct individuelles à l’aide d’ImageJ. Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour la segmentation manuelle des cellules. Enregistrez les régions pour l’étape suivante.
    2. Ouvrez le fichier de pile et rappelez les régions enregistrées pour chaque image. Ajustez le seuil de canal LDs.
    3. Mesurez l’intensité totale de fluorescence en sélectionnant multi-mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement.
      REMARQUE : Au cours de l’autophagie, l’intensité totale de la fluorescence et le nombre de LD peuvent changer de manière significative. De plus, les interactions entre les LD et les lysosomes augmentent pendant l’induction de l’autophagie.
  5. Analyse des contacts et de la colocalisation
    1. Effectuez une capture multispectrale à 1 s d’intervalle pendant 5 min à 37 °C.
    2. Réglez le laser à gaz argon multiligne à 10 % de puissance, avec la ligne laser 488 nm à 0,1 % à 0,5 % de puissance de travail pour minimiser les dommages cellulaires et sonder le photoblanchiment. Ajustez le laser de 568 nm à une puissance de 3 à 5 %.
    3. Cliquez sur ComDet V : les plugins < ComDet V 0.5.3 < détecter les particules. Définissez la distance minimale que les points doivent avoir pour être considérés comme colocalisés.
    4. Choisissez les paramètres qui définissent la particule, tels que sa taille (mm ou pixels) et son seuil, pour les deux couches indépendamment. Un résumé sera fourni avec le nombre de particules dans chaque canal pour chaque temps et le pourcentage de colocalisation correspondant, qui peut être exporté vers Excel (voir le fichier supplémentaire 1).
      REMARQUE : Le plugin ComDet V est recommandé pour les organites de forme ovale, tels que les gouttelettes lipidiques, les endosomes, les peroxysomes ou les lysosomes. Il n’est pas recommandé pour la colocalisation avec des organites comme les mitochondries. Le plugin « ComDet V » (distribution ImageJ FIJI) permet d’analyser la colocalisation temporelle grâce à l’analyse de particules. Pour l’installer aux Fidji, copiez l’URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/, allez dans Aide, Mettre à jour, sélectionnez Gérer les sites de mise à jour - Ajouter un site de mise à jour et collez l’URL. Appliquer les modifications ; Il est recommandé d’utiliser deux canaux. S’il y a plus de canaux, séparez-les et rejoignez-les à l’aide de l’option Fusionner.
  6. Mouvement dynamique des LD
    1. Définissez des zones d’intérêt (ROI) pour les billes et les cellules et enregistrez-les. Allez dans les plugins et sélectionnez Tracking et TrackMate.
    2. Ouvrez TrackMate. La première fenêtre du plugin fournit des informations sur les intervalles de temps auxquels les images sont capturées et la résolution de l’image. Pour confirmer les intervalles de temps sans apporter de modifications, cliquez sur SUIVANT.
    3. Sélectionnez Détecteur LoG , puis SUIVANT. Dans la configuration du détecteur LoG, filtrez les particules en fonction de leur diamètre, de 0,8 à 1,0 micron, et définissez un seuil approprié. Effectuez un aperçu pour confirmer les paramètres appropriés, puis cliquez sur SUIVANT.
    4. Définissez le seuil initial, un seuil de qualité qui limite le nombre de spots à analyser. Ceci est nécessaire lorsque l’on suit de nombreux endroits dans l’avion, ce qui est un défi. N’utilisez pas le filtre ; appuyez sur NEXT sans modifier les paramètres.
    5. Sélectionnez une vue : choisissez HyperStack Displayer et cliquez sur SUIVANT.
    6. Sélectionnez Traqueur LAP à mouvement linéaire pour les particules à vitesse constante dans le plan.
    7. Définissez la distance maximale entre deux points lors du démarrage d’une nouvelle trace. Selon les images, il est suggéré qu’il se situe entre 0,5 et 1 micron.
    8. Définissez la distance maximale à partir d’une position prédite pour les points candidats à l’analyse.
    9. Définissez l’écart d’image maximal comme la durée maximale de suivi d’un point susceptible de disparaître du plan focal. Nous recommandons deux points de temps.
    10. Sélectionnez Options d’affichage. Le tableau récapitulatif, y compris la vitesse minimale, la vitesse maximale, la vitesse moyenne, la vitesse médiane et le déplacement de la voie, est exporté vers Excel (voir le fichier supplémentaire 2).
    11. Sélectionnez Tracer les fonctions. Pour représenter visuellement les résultats, accédez à Pistes. Sélectionnez la mesure à représenter (vitesse et déplacement) sur l’axe X, et les points sont placés sur l’axe Y.
    12. Sélectionnez une action pour enregistrer des vidéos montrant le mouvement des taches. Cela permet de visualiser les points qui montrent des changements significatifs.
      REMARQUE : L’amélioration de l’autophagie optimise le flux cellulaire et réduit le nombre de LD, soulignant son rôle crucial dans la régulation métabolique et l’homéostasie cellulaire16. Les plugins mentionnés sont disponibles pour le logiciel ImageJ (distribution FIJI). Des logiciels équivalents peuvent également être utilisés. Pour toutes les mesures d’intensité de fluorescence, la densité de fluorescence intégrée (« RawIntDen » dans ImageJ) a été utilisée, qui tient compte de la fluorescence totale sur chaque pixel de l’image, en tenant compte de la zone.

2. Acquisition d’images confocales et analyse d’images entièrement automatisées dans des cellules fixes

REMARQUE : Cette méthode permet d’évaluer plusieurs conditions et d’élaborer des mesures en trois exemplaires pour chaque condition, ce qui améliore la confiance dans les valeurs moyennes mesurées et permet de déterminer l’écart-type ou l’erreur-type pour la différenciation statistique entre les expériences. Le flux de travail de la méthode est décrit dans l’organigramme illustré à la figure 1.

  1. Culture cellulaire
    1. Cultivez les cellules à 37 °C et à 5 % de CO2 dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % v/v de sérum fœtal bovin (FBS), 1 000 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et de l’amphotéricine B.
    2. Lavez les cellules avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), récoltée à l’aide de 0,25 % v/v de trypsine/EDTA.
    3. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.
    4. Centrifuger les cellules à température ambiante à 100 x g pendant 5 min.
    5. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette et conservez la pastille de cellule.
    6. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans un milieu de culture DMEM avec 10 % v/v FBS et semer dans des plaques optiques à fond de 96 puits (0,05 x 106 cellules/puits).
      REMARQUE : Les cellules sont incubées à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant de procéder aux traitements subséquents.
  2. Induction de l’autophagie par famine sérique
    1. Retirez le milieu de culture cellulaire et incubez les cellules dans un milieu DMEM privé de sérum pour éliminer le sérum et induire l’autophagie pendant 6 h.
    2. Utilisez la bafilomycine A1 200 nM pour inhiber la lipophagie de la LD. L’inhibiteur de la diacylglycérol acyltransférase-1 (DGAT1) T863 (50 μM) inhibe la biogenèse de la LD. Utilisez l’inhibiteur de la carnitine palmitoyltransférase I (CPT1), l’étomoxir (100 μM), pour inhiber la conversion des AGL en acyl-carnitine. De plus, la lipolyse peut être inhibée par l’utilisation d’ATGLstatine (10 μM).
  3. Fixation cellulaire
    1. Lavez les cellules trois fois avec du PBS-CM glacé (200 μL/puits).
    2. Fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde dilué dans du PBS complété par 0,1 mM de CaCl2 et 1 mM de MgCl2 (PBS-CM) à température ambiante pendant 15 min16.
    3. Lavez les cellules trois fois avec du PBS-CM (200 μL/puits).
    4. Perméabiliser avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS-CM à température ambiante pendant 15 min.
    5. Lavez les cellules trois fois avec du PBS-CM.
  4. Étiquetage des organites
    1. Incuber les cellules avec BODIPY 493/503 dilué à 0,5 μM et DAPI (125 mg/mL) dans du PBS-CM pendant 30 min à 37 °C.
    2. Lavez trois fois avec PBS-CM.
    3. Conserver les cellules fixées et colorées dans 200 μL de PBS par puits jusqu’à l’acquisition de l’image.
      REMARQUE : La plaque à 96 puits peut être stockée à 4 °C pendant plusieurs semaines, à l’abri de la lumière et de la déshydratation. Il n’est pas nécessaire de monter avec un support de montage anti-décoloration couramment utilisé.
  5. Microscopie confocale automatisée (cellules fixes)
    1. Effectuer la coloration des noyaux pour la segmentation automatisée de l’image16.
      REMARQUE : L’acquisition d’images utilise un microscope à disque rotatif avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x (N.A 1.1). L’acquisition DAPI est effectuée à l’aide d’un éclairage LED de 305 nm (Ex : 355-385 nm ; Em : 430-500 nm), et l’acquisition du BODIPY 493/503 est effectuée à l’aide d’un éclairage LED de 488 nm (Ex : 460-490 nm ; Em : 550-550 nm).
  6. Analyse d’images
    REMARQUE : L’analyse d’image16 est effectuée à l’aide d’un logiciel compatible avec un module d’analyse LD dédié. Le logiciel utilisé dans cette étude (voir Table des matériaux) dispose d’une combinaison d’algorithmes de solution prête à l’emploi (RMS Lipid Droplet Analysis) pour la segmentation et la quantification des images.
    1. Identifiez les noyaux en sélectionnant le canal DAPI et ajustez le seuil en fonction du signal et de l’arrière-plan.
    2. Identifiez le cytoplasme. Sélectionnez la méthode appropriée en fonction du canal de fluorescence LDs.
    3. Identifiez les spots en ajustant les paramètres : Rayon (1-1,5 μm), Contraste (0,2-0,25), Intensité spot à région non corrigée (0,4-0,6), Distance (0,3-0,4 μm), Rayon de crête du spot (0,2-0,25 μm).
    4. Calculez les propriétés morphologiques : sélectionnez LD de population, Spot de région et méthode standard , puis sélectionnez Zone.
    5. Calculer les propriétés d’intensité : sélectionnez le canal LDs , les LD de population, le spot de région et la méthode standard .
    6. Calculer les propriétés : sélectionnez la population de toutes les cellules, sélectionnez la méthode par LD de population associées, puis sélectionnez le nombre de LD, la surface et l’intensité (moyenne et somme ; la somme est la densité/intensité de fluorescence intégrée). Cela permettra d’obtenir des mesures LD liées à la cellule.
    7. Définissez les résultats en sélectionnant Sortie standard, Nombre d’objets, Nombre de LD par cellule exprimé en moyenne ± SD, LD moyenne par surface, LD total par zone, Fractions de LD par zone et Intensité totale des LD.

Résultats

Imagerie confocale de cellules vivantes
Les LD sont dynamiques et interagissent transitoirement avec les autophagosomes positifs à p62/SQSTM1. Lorsque la lipophagie est induite, ces interactions diminuent le nombre de LD et leur intensité fluorescente totale. Ce protocole a utilisé des versions phospho-mutantes du récepteur de l’autophagie p62/SQSTM1 pour examiner ces effets16.

Le nombre et l’intensité de fl...

Discussion

Les techniques d’imagerie quantitative, telles que la microscopie confocale et les protocoles d’analyse d’images, ont fourni des informations précieuses sur la dynamique des ML au cours de la lipophagie 16,42,43. Ces technologies permettent de visualiser et de quantifier en temps réel les LD, ce qui permet d’analyser leur nombre, leur taille et leurs interactions avec d’autres organi...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le microscope confocal robotisé Operetta a été financé par la subvention N° EQM220072 du Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP). C.L. a été soutenu par la bourse de doctorat de la Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), de l’Universidad San Sebastian. C.S. a été soutenu par la bourse de l’Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. et J.C. ont été soutenus par la bourse N°1221374 du Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

Références

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