Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

요약

지방파지(Lipophagy)는 지질 방울의 분해를 포함하는 선택적 형태의 자가포식입니다. 이 과정의 기능 장애는 암 발병과 관련이 있습니다. 그러나 정확한 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 간의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위한 정량적 이미징 접근 방식을 설명합니다.

초록

일반적으로 자가포식(autophagy)이라고 하는 대자가포식(macroautophagy)은 세포 구성 요소의 분해를 담당하는 고도로 보존된 세포 과정입니다. 이 과정은 단식, 세포 스트레스, 세포 기관 손상, 세포 손상 또는 세포 구성 요소의 노화와 같은 조건에서 특히 두드러집니다. 자가포식(autophagy) 동안, 세포질의 한 부분은 자가포식솜(autophagosome)으로 알려진 이중막 소포(double-membrane vesicles) 내에 둘러싸여서 리소좀(lysosome)과 융합합니다. 이 융합 후, 자가포식소체의 내용물은 리소좀에 의해 촉진되는 비선택적 벌크 분해를 겪습니다. 그러나 자가포식은 미토콘드리아, 과산화소체, 리소좀, 핵 및 지질 방울(LD)을 포함한 특정 소기관을 표적으로 하는 선택적 기능도 나타냅니다. 지질 방울은 세포질에서 중성 지질을 분리하는 인지질 단층으로 둘러싸여 있어 과도한 스테롤과 유리 지방산(FFA)의 유해한 영향으로부터 세포를 보호합니다. 자가포식은 신경퇴행성 질환, 대사 장애, 암 등 다양한 질환과 관련이 있습니다. 특히, 지질 방울의 자가포식 의존적 분해인 지질(lipophagy)은 다양한 대사 상태에 걸쳐 세포 내 FFA 수치를 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 조절은 막 합성, 신호 분자 형성 및 에너지 균형과 같은 필수 과정을 지원합니다. 결과적으로, 손상된 지방질은 죽음 자극에 대한 세포의 취약성을 증가시키고 암과 같은 질병의 발병에 기여합니다. 그 중요성에도 불구하고, 암세포에서 지방질에 의해 조절되는 지질 방울 대사를 제어하는 정확한 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 이 논문은 암세포의 대사 변화와 관련된 지방질(lipophagy)을 조사할 수 있는 컨포칼 이미징 획득 및 정량적 이미징 분석 프로토콜에 대해 설명하는 것을 목표로 합니다. 이러한 프로토콜을 통해 얻은 결과는 자가포식, 지질 대사 및 암 진행 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다. 이러한 메커니즘을 설명함으로써 암 및 기타 대사 관련 질병과 싸우기 위한 새로운 치료 표적이 등장할 수 있습니다.

서문

자가포식(Autophagy)은 세포가 분해를 위해 구성 요소를 리소좀으로 운반하는 이화 과정을 설명하는 데 사용되는 일반적인 용어입니다. 현재까지 세 가지 유형의 자가포식이 확인되었습니다: 미세자가포식(microautophagy), 거대자가포식(macroautophagy), 샤페론 매개 자가포식(chaperone-mediated autophagy) ^1,2,3. 대자가포식(Macroautophagy)은 세포 항상성을 조절하는 데 필수적인 경로입니다. 이 균형이 깨지면 병리학적 상태가 발생할 수 있다⁴.

자가포식은 여러 단계를 포함하는 복잡한 과정입니다. 첫 번째 단계는 자가포식 유도로, 성장 인자(인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자)의 철회, 병원성 감염, 세포 에너지 수준(ATP) 감소, 세포 외 또는 세포 내 스트레스(예: 저산소증, 소포체(ER) 스트레스, 산화 스트레스) 및 영양 결핍(아미노산, 포도당)과 같은 다양한 자극에 의해 유발됩니다^.5. 두 번째 단계는 식체(phagophore)의 형성과 관련이 있으며, 여기서 ER, 원형질막 및 미토콘드리아에서 막 분리가 시작됩니다. De novo formation은 Ser/Thr kinase Unc-51-like kinase-1 complex⁽ULK1: 효모 내 ATG1), Beclin-1 및 VPS34⁷과 같이 순차적으로 모집되는 세포질 단백질의 보존 메커니즘을 포함합니다. ULK1 복합체가 형성된 후, 클래스 III 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 복합체 I은 화물의 초기 격리 기능인 격리막(IM)에 모집됩니다(⁸). 또한, ULK1 복합체는 ATG9를 분리막(IM)으로 모집할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이는 ATG9 소포가 IM 확장⁹을 촉진하는 막 운반체로 인식되기 때문에 필수적인 단계입니다.

두 개의 유비퀴틴 유사(Ubl) 접합 시스템, 즉 미세소관 관련 단백질 1 경쇄 3(LC3-I) 시스템과 ATG12 시스템¹⁰이 확장 과정에 중요합니다. 접합 전에 LC3 전구체는 절단을 거칩니다. 그런 다음 세포질 LC3-I를 포스파티딜에탄올아민(PE)에 접합하여 자가포식솜 형성을 촉진하는 막 관련 LC3-PE(LC3-II)를 생성합니다¹¹. 화물은 이 과정에서 형성되는 이중막 자가포식솜으로 내부화되어야 합니다. 자가포식은 분해를 위해 무작위 표적을 내부화하거나 p62/SQSTM1¹²와 같은 특정 자가포식 수용체를 통해 선택적 화물을 포획할 수 있습니다. 마지막 단계는 형성된 자가포식솜과 리소좀의 융합으로 자가분해좀 형성으로 이어집니다. 자가분해솜 형성에 대한 정확한 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵지만, 막-테더링 복합체, RAS 관련 GTP-결합 단백질 및 용해성-N-에틸말레이미드 민감성 인자 부착 단백질 수용체(SNARE) 단백질이 이 융합 과정에 관여합니다¹³. 또한, 미세소관 세포골격 시스템은 자가분해솜 형성을 위해 무작위 시작 부위에서 핵주위 영역으로 성숙한 자가포식솜 및 리소좀을 이동하는 데 필수적입니다 14,15,16. 자가분해소좀(autolysosome)에서, 무작위 또는 선택적으로 격리된 화물은 리소좀 프로테아제(lysosomal protease)에 의해 단백질분해된다(¹⁷).

자가포식 과정은 모든 진핵생물에 걸쳐 보존되며 세포질 회전을 통해 세포 내 상태를 조절하는 데 중요합니다. 잘못 접히거나 응집된 단백질을 제거하고, 세포 내 병원체를 제거하며, 손상된 소기관을 제거합니다. 소포체, 미토콘드리아, 과산화소체, 리소좀, 핵 및 LD를 포함한 여러 소기관이 자가포식 16,18,19,20,21,22의 표적으로 보고되었습니다. LD는 응급실에서 유래하며 지질 및 에너지 항상성의 중심이 되는 필수 저장 소기관입니다. 이들의 독특한 구조는 특정 단백질이 내장된 인지질 단층으로 둘러싸인 중성 지질의 소수성 코어로 구성됩니다. 이러한 액적은 막 접촉 부위를 통해 다양한 세포 소기관과 상호 작용할 수 있습니다²³. 또한 자가포식은 최적의 세포 상태를 유지하기 위해 주요 자원을 재활용하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, LD의 분해는 지방산 β산화를 통한 ATP 생산으로 이어질 수 있습니다²⁴.

자가포식은 신경퇴행성 질환, 대사 장애, 암 등 다양한 질병과 관련이 있다¹⁷. 자가포식(autophagy)은 상황에 따라 암의 종양 성장을 촉진하거나 억제할 수 있다^25,26. 예를 들어, Beclin 1 +/- 마우스는 폐, 간, 유방 조직과 같은 기관에서 자발적 림프종과 암종의 발병률이 높습니다. 반대로, 장 상피 세포에서 자가포식 관련 유전자 Atg7의 손실은 결장직장암의 주요 종양 억제 인자인 선종성 용종증 대장균(APC)의 손실로 인한 종양 성장을 약화시킵니다^27,28. 따라서 자가포식 관련 유전자의 손실은 종양 성장에 반대 효과를 미칠 수 있습니다.

암세포는 성장, 분열 및 생존을 유지하기 위해 에너지를 생산해야 합니다²⁹. 그들은 구조적 구성 요소의 생합성과 에너지 생산에 사용되는 지질에 대한 높은 열광도를 가지고 있습니다³⁰. 암세포는 환경 조건에 따라 신진대사를 조절할 수 있습니다. 예를 들어, 자궁경부암 유래 HeLa 세포에서 해당작용이 억제되면 생존에 필요한 ATP를 얻기 위해 산화적 인산화가 증가합니다³¹. 세포 내 지질은 고농도에서 잠재적인 세포 독성으로 인해 비에스테르화 FFA로 존재하지 않습니다. 대신, 세포는 FFA와 콜레스테롤을 스테롤 에스테르 및 트리글리세리드와 같은 중성, 불활성 생체 분자로 LD에 저장합니다³². 결과적으로, 지방질은 에너지를 생산하기 위해 FFA를 공급함으로써 암 대사에 기여할 수 있으며, 이는 암 연구에서 새로운 분야입니다. 그러나 암세포에서 미토콘드리아 FA 산화를 상향 조절하는 경로는 아직 잘 알려져 있지 않습니다. FFA의 흡수 및 축적은 다양한 유형의 암의 공격성을 향상시키는 것으로 나타났습니다 33,34,35. 지질 대사 재프로그래밍(Lipid metabolism reprogramming)은 암 대사 재프로그래밍(cancer metabolic reprogramming)의 특징이며, 종양 미세환경에서 불리한 생리학적 시나리오를 관리하기 위한 적응 반응(adaptive response)으로서 중추적인 역할을 한다^36,37. 실제로, LD의 축적은 폐암, 유방암, 전립선암을 포함한 많은 인간 암에서 관찰되었으며, 공격성 및 나쁜 임상 예후와 관련이 있다 38,39,40.

암 대사에서 자가포식과 LD의 관련성과 잘 이해되지 않은 메커니즘을 감안할 때, 암 발병에 대한 자가포식 및 LD의 기여도를 연구하기 위한 프로토콜을 수립하는 것이 필수적입니다. 본 연구는 암세포의 지질 대사 변화를 조사하기 위해 컨포칼 이미징 획득 및 정량적 이미징 분석 프로토콜을 통해 지방을 평가하는 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

본 연구는 상피선암종 HeLa 세포(CCL2, ATCC)를 사용하여 수행되었습니다. 이 프로토콜은 야생형(p62/SQSTM1-S182S)과 자가포식 수용체 p62/SQSTM1의 두 부위 특이적 돌연변이를 발현하는 세포에서 LD 수 변이 및 LD-자가포식솜 상호작용의 시간 경과를 정량화하기 위해 살아있는 세포에서 지질 유도 중 지질 방울(LD)을 연구하는 데 중점을 둡니다¹⁶. phospho-defective form (p62/SQSTM1-S182A)의 발현은 LD의 수를 증가시키는 반면, phospho-mimicking form (p62/SQSTM1-S182E)의 발현은 LD의 수를 감소시킨다¹⁶. 먼저, 컨포칼 현미경을 이용하여 살아있는 세포의 LD를 분석하는 방법에 대해 설명한다. 그런 다음 로봇 공초점 현미경을 사용하여 편향되지 않은 완전 자동화된 이미지 획득 및 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 컨포칼 라이브 셀 이미징

1. 세포 배양
   1. 10% v/v 소 태아 혈청(FBS), 1,000 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 암포테리신 B를 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 37°C 및 5% CO₂ 에서 세포를 배양합니다. 세포가 80% 이하의 포화도에 도달할 때까지 세포를 유지합니다.
   2. 1mL의 1x 인산염 완충 식염수로 세포를 세척하고 0.25% v/v 트립신/EDTA를 사용하여 수집한 다음 실온에서 5분 동안 100 x g 으로 원심분리합니다.
   3. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기합니다.
   4. 10% v/v FBS와 seed(0.05 x 10⁶ cells/well)로 DMEM 배양 배지의 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 재현탁합니다.
   5. TransIT-LT1 transfection 또는 Lipofectamine 2000 시약을 사용하여 세포를 transfection합니다. 각 p62/SQSTM1-mcherry phospho-variants 및 wild-type p62/SQSTM1-mcherry¹⁶의 1 μg plasmid DNA를 사용합니다.
   6. 후속 처리를 진행하기 전에 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 48 시간 동안 세포를 배양합니다.
      참고: transfection 후 16-24시간에 p62/SQSTM1은 별개의 p62/SQSTM1 자가포식소체가 아닌 큰 응축물을 형성합니다. 이러한 큰 응축물은 48시간 표시까지 대부분 소멸되어 자가포식소체를 보다 정확하게 관찰할 수 있습니다.
2. 소기관 라벨링
   1. 유리 바닥 접시에 담긴 세포를 1x PBS(37°C로 예열)로 두 번 세척합니다.
   2. 10mM HEPES가 보충된 DMEM 배지에서 0.5μM로 희석된 BODIPY 493/503으로 세포를 배양하고 37°C, 5% CO₂에서 30분 동안 유지합니다. BODIPY 405 및 BODIYPY 633도 동일한 결과로 사용할 수 있습니다.
   3. p62/SQSTM1 변이체의 발현이 LD 수 및 총 형광 강도의 변화를 유도하는지 확인합니다.
   4. 1x PBS(실온)로 세포를 세척하고 살아있는 세포 이미징을 위해 10mM ES 인증 HEPES 완충액이 보충된 적색 페놀이 없는 DMEM으로 유지합니다.
      참고: BODIPY 493/503은 밝은 녹색 형광을 방출하여 이중 형광 라벨링에 편리합니다. 그러나 반복적인 여기(excitation)와 같은 특정 조건에서는 적색 형광을 방출할 수 있으며, 적색 마커와 결합할 때 잠재적으로 잘못된 해석(잘못된 공동 국소화)으로 이어질 수 있습니다. 550nm 여기 형광단에 대한 자세한 내용은 Ohsaki et ^al.41의 기사를 참조하십시오.
3. 라이브 셀 이미징에서 컨포칼 현미경 이미지 획득
   참고: LD의 이미지는 63x 오일 이멀젼 대물렌즈(N.A. 1.4)가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득합니다. 호환 가능한 이미지 획득 소프트웨어가 이미지를 캡처하는 데 사용되었습니다. 자동 온도 제어 시스템을 사용하여 온도를 37°C로 유지합니다.
   참고: 지질 방울(LD)의 이미지는 63x 오일 이멀젼 대물렌즈(N.A. 1.4)가 있는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 호환 가능한 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처했습니다. 온도는 자동 온도 제어 시스템을 사용하여 37°C로 유지되었습니다.
   1. 488nm 레이저 라인을 1%-2%의 작동 효율로 여러 라인 아르곤 가스 레이저를 10% 작동 전력으로 조정하여 전체 레이저 출력을 0.1%-0.2%로 조정합니다.
   2. 세포 손상과 프로브 광표백을 최소화하려면 568nm 레이저를 3%-5% 효율로 조정하십시오.
   3. 소프트웨어에서 이미지 획득 설정을 1024 x 1024 픽셀의 해상도로 조정합니다. 이 시스템은 600Hz에서 작동하는 하이브리드 감지기를 사용하며 평균 2입니다.
   4. 478-494nm(LD의 경우 녹색 방출)와 600-625nm 파장(mCherry의 경우 빨간색 방출) 사이의 스펙트럼 범위를 조정합니다.
   5. 488nm 파장에 대해 핀홀 크기를 1AU(Airy Unit)로 조정합니다.
   6. PKA 키나아제를 활성화하고 LDs 분해를 증가시키기 위해 8-Br-cAMP(100 mM)로 세포를 배양합니다¹⁶.
   7. 5분 간격, 37°C에서 60분 간격으로 형광 이미지를 캡처합니다.
4. 이미지 분석
   1. ImageJ를 사용하여 개별 라이브 이미지 시퀀스가 포함된 스택 파일을 엽니다. 수동 셀 분할을 위해 ROI 관리자를 사용합니다. 다음 단계를 위해 영역을 저장합니다.
   2. 스택 파일을 열고 각 이미지에 대해 저장된 영역을 불러옵니다. LD 채널 임계값을 조정합니다.
   3. ROI 관리자에서 multi-measure 를 선택하여 총 형광 강도를 측정합니다.
      참고: 자가포식 중에는 총 형광 강도와 LD의 수가 크게 변할 수 있습니다. 또한 LD와 리소좀 간의 상호 작용은 자가포식 유도 중에 증가합니다.
5. 접촉체 및 공동 국소화 분석
   1. 37°C에서 5분 동안 1초 간격으로 멀티 스펙트럼 캡처를 수행합니다.
   2. 세포 손상을 최소화하고 광표백을 프로브하기 위해 0.1%-0.5%의 작동 전력에서 488nm 레이저 라인과 함께 멀티라인 아르곤 가스 레이저를 10% 효율로 설정합니다. 568nm 레이저를 3%-5% 효율로 조정합니다.
   3. ComDet V: Plugins < ComDet V 0.5.3을 클릭하여 입자를 감지<. 포인트가 동일 국소화된 것으로 간주되어야 하는 최소 거리를 정의합니다.
   4. 입자를 정의하는 매개변수(예: 크기(mm 또는 픽셀 단위) 및 임계값)을 두 채널에 대해 독립적으로 선택합니다. 각 시간에 대한 각 채널의 입자 수와 해당 공동 국소화 비율이 포함된 요약이 제공되며, 이를 Excel로 내보낼 수 있습니다( 보충 파일 1 참조).
      참고: ComDet V 플러그인은 지질 방울, 엔도솜, 과산화소체 또는 리소좀과 같은 타원형 모양의 소기관에 권장됩니다. 미토콘드리아와 같은 소기관과의 공동 국소화에는 권장되지 않습니다. "ComDet V" 플러그인(ImageJ FIJI 분포)을 사용하면 입자 분석을 통해 시간적 공동 국소화를 분석할 수 있습니다. 피지에 설치하려면 URL을 http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ 복사하고 도움말, 업데이트로 이동하여 업데이트 사이트 관리 - 업데이트 사이트 추가를 선택하고 URL을 붙여넣습니다. 변경 사항을 적용합니다. 두 개의 채널을 사용하는 것이 좋습니다. 채널이 더 많으면 채널을 분리하고 병합을 사용하여 다시 참가합니다.
6. LD의 동적 움직임
   1. 비드와 세포에 대한 관심 영역(ROI)을 정의하고 저장합니다. 플러그인으로 이동하여 추적 및 TrackMate를 선택합니다.
   2. TrackMate를 엽니다. 플러그인의 첫 번째 창은 이미지가 캡처되는 시간 간격과 이미지 해상도에 대한 정보를 제공합니다. 변경하지 않고 시간 간격을 확인하려면 다음을 클릭하십시오.
   3. LoG detector를 선택한 다음 NEXT를 선택합니다. LoG 검출기 구성에서 0.8-1.0 미크론의 직경에 따라 입자를 필터링하고 적절한 임계값을 설정합니다. 미리보기를 수행하여 적절한 매개변수를 확인하고 다음을 클릭합니다.
   4. 분석할 스폿 수를 제한하는 품질 임계값인 초기 임계값을 설정합니다. 이것은 비행기의 많은 지점을 따라갈 때 필요하며 이는 도전적입니다. 필터를 사용하지 마십시오. 매개변수를 변경하지 않고 NEXT 를 누릅니다.
   5. 보기 선택: HyperStack Displayer 를 선택하고 NEXT를 클릭합니다.
   6. 평면에서 일정한 속도를 가진 파티클에 대해 선형 모션 LAP 추적기 를 선택합니다.
   7. 새 트랙을 시작할 때 두 지점 사이의 최대 거리를 정의합니다. 이미지에 따라 0.5 -1 미크론 사이로 제안됩니다.
   8. 분석할 후보 스폿에 대해 예측 위치로부터의 최대 거리를 설정합니다.
   9. Max Frame Gap을 초점 평면에서 사라질 수 있는 지점을 따라가는 최대 시간으로 설정합니다. 두 개의 시점을 권장합니다.
   10. 디스플레이 옵션을 선택합니다. 최소 속도, 최대 속도, 평균 속도, 중간 속도 및 트랙 변위를 포함한 요약 테이블을 Excel로 내보냅니다(보충 파일 2 참조).
   11. 플롯 피처를 선택합니다. 결과를 시각적으로 나타내려면 Tracks(트랙)로 이동합니다. X축에서 나타낼 측정(속도 및 변위)을 선택하고 스폿은 Y축에 배치됩니다.
   12. 액션을 선택하여 스팟의 움직임을 보여주는 비디오를 저장합니다. 이를 통해 중요한 변화를 보여주는 지점을 시각화할 수 있습니다.
       참고: 자가포식을 강화하면 세포 플럭스가 최적화되고 LD 수가 감소하여 대사 조절 및 세포 항상성에서 LD 플럭스가 중요한 역할을 한다는 사실이 강조됩니다¹⁶. 언급된 플러그인은 ImageJ 소프트웨어(FIJI 배포)에서 사용할 수 있습니다. 동등한 소프트웨어도 사용할 수 있습니다. 모든 형광 강도 측정에는 통합 형광 밀도(ImageJ의 "RawIntDen")가 사용되었으며, 이는 각 이미지 픽셀의 총 형광을 고려하여 영역을 고려합니다.

2. 고정 세포에서 완전 자동화된 공초점 이미지 획득 및 이미지 분석

참고: 이 방법을 사용하면 여러 조건을 평가하고 각 조건에 대한 삼중 측정을 개발하여 평균 측정값의 신뢰도를 높이고 실험 간의 통계적 차별화를 위해 표준 편차 또는 표준 오류를 결정할 수 있습니다. 이 방법의 워크플로우는 그림 1에 표시된 순서도에 표시되어 있습니다.

1. 세포 배양
   1. 10% v/v 소 태아 혈청(FBS), 1,000 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 암포테리신 B를 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 37°C 및 5% CO₂ 에서 세포를 배양합니다.
   2. 0.25% v/v 트립신/EDTA를 사용하여 수확한 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL로 세포를 세척합니다.
   3. 15mL 원심분리 튜브에 세포를 모읍니다.
   4. 실온에서 100 x g 로 5분 동안 셀을 원심분리합니다.
   5. 피펫으로 상등액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 보관하십시오.
   6. 세포 펠릿을 10% v/v FBS로 DMEM 배양 배지에 재현탁시키고 광학 바닥 96웰 플레이트(0.05 x 10,⁶ 세포/웰)에 시드합니다.
      참고: 세포는 후속 처리를 진행하기 전에 24시간 동안 37°C 및 5% CO₂ 에서 배양됩니다.
2. 혈청 결핍에 의한 자가포식 유도
   1. 세포 배양 배지를 제거하고 혈청이 결핍된 DMEM 배지에서 세포를 배양하여 혈청을 제거하고 6시간 동안 자가포식을 유도합니다.
   2. LD 지질파지를 억제하기 위해 bafilomycin A1 200 nM을 사용하십시오. Diacylglycerol acyltransferase-1 (DGAT1) 억제제 T863 (50 μM)은 LD 생물 발생을 억제합니다. 카르니틴 팔미토일전이효소 I(CPT1) 억제제 에토목시르(100μM)를 사용하여 FFA가 아실-카르니틴으로 전환되는 것을 억제합니다. 게다가, lipolysis는 ATGLstatin (10 μM)를 사용하여 금할 수 있습니다.
3. 세포 고정
   1. 얼음처럼 차가운 PBS-CM(200μL/well)으로 세포를 세 번 세척합니다.
   2. 0.1mM CaCl₂ 및 1mM MgCl₂ (PBS-CM)가 보충 된 PBS에 희석 된 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 15 분 동안 세포를 고정합니다¹⁶.
   3. PBS-CM(200μL/well)으로 세포를 3회 세척합니다.
   4. PBS-CM에 0.2% Triton X-100을 넣고 실온에서 15분 동안 투과시킵니다.
   5. PBS-CM으로 세포를 세 번 세척합니다.
4. 소기관 라벨링
   1. 0.5μM로 희석한 BODIPY 493/503과 PBS-CM의 DAPI(125mg/mL)로 37°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
   2. PBS-CM으로 세 번 씻습니다.
   3. 이미지 획득 전까지 웰당 200μL의 PBS에 고정 및 염색된 세포를 유지합니다.
      참고: 96웰 플레이트는 4°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 빛과 탈수로부터 보호됩니다. 일반적으로 사용되는 페이드 방지 장착 매체를 사용한 장착은 필요하지 않습니다.
5. 자동 컨포칼 현미경 검사(고정 세포)
   1. 자동 이미지 분할을 위한 핵 염색^{수행 16}.
      참고: 이미지 획득은 40x(N.A 1.1) 침수 대물렌즈가 있는 회전 디스크 현미경을 사용합니다. DAPI 획득은 305nm LED 조명(예: 355-385nm; Em: 430-500 nm) 및 BODIPY 493/503 획득은 488 nm LED 조명(예: 460-490 nm; Em: 550-550 nm).
6. 이미지 분석
   참고: 이미지 분석¹⁶ 은 전용 LD 분석 모듈과 호환되는 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 이 연구에 사용된 소프트웨어( 재료 표 참조)에는 이미지 분할 및 정량화를 위한 기성 솔루션(RMS 지질 액적 분석) 알고리즘 조합이 있습니다.
   1. DAPI 채널을 선택하여 핵을 식별하고 신호 및 배경에 따라 임계값을 조정합니다.
   2. 세포질을 확인합니다. LD 형광 채널에 따라 적절한 방법을 선택합니다.
   3. 매개변수를 조정하여 스폿을 식별합니다: 반경(1-1.5 μm), 대비(0.2-0.25), 보정되지 않은 스폿 대 영역 강도(0.4-0.6), 거리(0.3-0.4 μm), 스폿 피크 반경(0.2-0.25 μm).
   4. 형태학 속성 계산: 모집단 LD, 지역 스폿 및 표준 방법을 선택한 다음 영역을 선택합니다.
   5. 강도 속성 계산: LDs 채널, population LD, Region Spot 및 standard method를 선택합니다.
   6. 속성 계산: 모든 세포의 모집단을 선택하고 관련 모집단 LD별로 방법을 선택한 다음 LD 수, 면적 및 강도(평균 및 합계, 합계는 형광 밀도/강도를 통합함)를 선택합니다. 이렇게 하면 세포와 관련된 LD 측정값이 생성됩니다.
   7. 표준 출력, 개체 수, 평균 ± SD로 표현되는 셀당 LD의 수, 영역당 평균 LD, 영역당 총 LD, 영역당 LD 분수 및 총 LDs 강도를 선택하여 결과를 정의합니다.

결과

컨포칼 라이브 셀 이미징
LD는 동적이며 p62/SQSTM1 양성 자가포식소체와 일시적으로 상호 작용합니다. 지방질이 유도되면 이러한 상호 작용은 LD의 수와 총 형광 강도를 감소시킵니다. 이 프로토콜은 이러한 효과를 조사하기 위해 자가포식 수용체 p62/SQSTM1의 인(phospho-mutant) 버전을 사용했습니다¹⁶.

LD의 수와 형광 강도는 p...

토론

컨포칼 현미경 및 이미지 분석 프로토콜과 같은 정량적 이미징 기술은 지방질 분석 중 LD의 역학에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다 16,42,43. 이러한 기술은 LD의 실시간 시각화 및 정량화를 가능하게 하여 LD의 수, 크기 및 다른 소기관과의 상호 작용을 분석할 수 있습니다¹⁶. 그러나...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1	Tocris	1334	200 nM
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	0.5 mM
CaCl2	Merck	102378	0.1 mM
ComDet V Plugin	ImageJ	ImageJ FIJI
DAPI	Invitrogen	D1306	125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Gibco	12800017
ES-qualified HEPES buffer	Cytiva HyClone AdvanceSTEM	SH3085101	10 mM
Etomoxir	SigmaAldrich	E1905	100 mM
Fetal Bovine Serum	Cytiva HyClone AdvanceSTEM	SH3039603	10% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 Incubator	Thermo Scientific	3111	37 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic software	Revvity		image analysis software
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPES	Merck	110110	10 mM
High-speed clinical centrifuge	DLAB	DM0412
Immersion Oil	Leica	11513859
MgCl2	Merck	814733	1 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscope	Revvity	HH16000020
Optical bottom 96-well plates	Thermo Scientific	165305
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	4%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin B	Biological Industries	030331b	(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sartorius	020235A	1x
Red-phenol free DMEM	Gibco	31053028
T863	Merck	SML0539	50 mM
TCS SP8 Leica confocal microscope	Leica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2304
Triton X-100	Merck	T9284	0.20%
Trypsin/EDTA	Gibco	252000056	0.25% v/v
UNO-TEMP controller	Okolab	OK-H401-T-CONTROLLER	37 °C