JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ליפופגיה היא צורה סלקטיבית של אוטופגיה הכוללת פירוק של טיפות שומנים. תפקוד לקוי בתהליך זה קשור להתפתחות סרטן. עם זאת, המנגנונים המדויקים עדיין לא מובנים במלואם. פרוטוקול זה מתאר גישות הדמיה כמותית כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין בין אוטופגיה, מטבוליזם של שומנים והתקדמות סרטן.

Abstract

מקרו-אוטופגיה, המכונה בדרך כלל אוטופגיה, היא תהליך תאי שמור מאוד האחראי לפירוק רכיבים תאיים. תהליך זה בולט במיוחד בתנאים כמו צום, לחץ תאי, נזק לאברונים, נזק לתאים או הזדקנות של רכיבים תאיים. במהלך אוטופגיה, קטע של הציטופלזמה סגור בתוך שלפוחיות כפולות הידועות בשם אוטופאגוזומים, אשר לאחר מכן מתמזגות עם ליזוזומים. בעקבות היתוך זה, תכולת האוטופאגוזומים עוברת פירוק לא סלקטיבי בתפזורת המקלה על ידי ליזוזומים. עם זאת, אוטופגיה מציגה גם פונקציונליות סלקטיבית, המכוונת לאברונים ספציפיים, כולל מיטוכונדריה, פרוקסיזומים, ליזוזומים, גרעינים וטיפות שומנים (LDs). טיפות שומנים סגורות על ידי חד-שכבת פוספוליפידים המבודדת שומנים ניטרליים מהציטופלזמה, ומגינה על התאים מפני ההשפעות המזיקות של עודף סטרולים וחומצות שומן חופשיות (FFAs). אוטופגיה מעורבת במצבים שונים, כולל מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן. באופן ספציפי, ליפופגיה - הפירוק התלוי באוטופגיה של טיפות שומנים - ממלא תפקיד מכריע בוויסות רמות ה-FFA התוך תאיות במצבים מטבוליים שונים. ויסות זה תומך בתהליכים חיוניים כגון סינתזת ממברנות, יצירת מולקולות איתות ואיזון אנרגיה. כתוצאה מכך, ליפופגיה לקויה מגבירה את הפגיעות התאית לגירויי מוות ותורמת להתפתחות מחלות כמו סרטן. למרות חשיבותה, המנגנונים המדויקים השולטים במטבוליזם של טיפות שומנים המווסתים על ידי ליפופגיה בתאי סרטן נותרו לא מובנים היטב. מאמר זה נועד לתאר רכישת הדמיה קונפוקלית ופרוטוקולי ניתוח הדמיה כמותית המאפשרים חקירה של ליפופגיה הקשורה לשינויים מטבוליים בתאים סרטניים. התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקולים אלה עשויות לשפוך אור על יחסי הגומלין המורכבים בין אוטופגיה, חילוף חומרים של שומנים והתקדמות סרטן. על ידי הבהרת מנגנונים אלה, עשויות להופיע מטרות טיפוליות חדשות למאבק בסרטן ובמחלות מטבוליות אחרות.

Introduction

אוטופגיה היא מונח כללי המשמש לתיאור תהליכים קטבוליים בהם התא מעביר את מרכיביו לליזוזום לצורך פירוק. עד כה זוהו שלושה סוגים של אוטופגיה: מיקרו-אוטופגיה, מקרו-אוטופגיה ואוטופגיה בתיווך מלווה 1,2,3. מקרו-אוטופגיה, המכונה להלן אוטופגיה, היא מסלול חיוני לוויסות הומאוסטזיס תאי. הפרעה באיזון זה עלולה להוביל להתפתחות מצבים פתולוגיים4.

אוטופגיה היא תהליך מורכב הכולל מספר שלבים. השלב הראשון הוא השראת אוטופגיה, המופעלת על ידי גירויים שונים כגון נסיגה של גורמי גדילה (אינסולין וגורמי גדילה דמויי אינסולין), זיהומים פתוגניים, רמות אנרגיה תאיות מופחתות (ATP), מתח חוץ-תאי או תוך-תאי (למשל, היפוקסיה, עקה של רשתית אנדופלזמית (ER), עקה חמצונית) ומחסור בחומרים מזינים (חומצות אמינו, גלוקוז)5. השלב השני כולל היווצרות הפגופור, שם מתחיל בידוד הממברנה מה-ER, קרום הפלזמה והמיטוכונדריה. היווצרות דה נובו כרוכה במכונות משומרות של חלבונים ציטוזוליים המגויסים ברצף6, כגון קומפלקס קינאז דמוי Unc-51 (ULK1: ATG1 בשמרים), Beclin-1 ו-VPS347. לאחר היווצרות קומפלקס ULK1, קומפלקס פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K) מסוג III מגויס לממברנה המבודדת (IM), המתפקדת בבידוד ראשוני של מטענים8. יתר על כן, לקומפלקס ULK1 יש את היכולת לגייס ATG9 לקרום הבידוד (IM), צעד חיוני מכיוון ששלפוחיות ATG9 מוכרות כנשאיות ממברנה המקלות על התרחבות IM9.

שתי מערכות צימוד דמויות יוביקוויטין (Ubl) הן קריטיות לתהליך ההתפשטות: מערכת חלבון 1 שרשרת קלה 3 (LC3-I) הקשורה למיקרו-צינוריות ומערכתATG12 10. לפני ההצמדה, קודמן ה-LC3 עובר מחשוף. לאחר מכן, ה-LC3-I הציטוזולי מצומד לפוספטידיל-אתנולמין (PE) כדי לייצר את ה-LC3-PE הקשור לממברנה (LC3-II), המאפשר היווצרות אוטופאגוזום11. יש להפנים את המטען לתוך האוטופאגוזום הכפול היוצר במהלך תהליך זה. אוטופגיה יכולה להפנים מטרות אקראיות לפירוק או ללכוד מטענים סלקטיביים באמצעות קולטני אוטופגיה ספציפיים כגון p62/SQSTM112. השלב האחרון הוא היתוך של האוטופאגוזום שנוצר עם ליזוזומים, מה שמוביל להיווצרות אוטוליזוזום. למרות שהמנגנון המדויק להיווצרות אוטוליזוזום נותר חמקמק, קומפלקסים של קשירת ממברנה, חלבון קושר GTP הקשור ל-RAS, וחלבוני קולטני חלבון הצמדת גורם רגיש לגורם מסיס-N-ethylmaleimide (SNARE) מעורבים בתהליך היתוך זה13. יתר על כן, מערכת השלד הציטולוגי של המיקרו-צינורות חיונית להובלת אוטופאגוזומים וליזוזומים בוגרים מאתרי התחלה אקראיים לעבר האזור הפרי-גרעיני להיווצרות אוטוליזוזום 14,15,16. באוטוליזוזום, המטענים המבודדים באופן אקראי או סלקטיבי מתפרקים באופן פרוטאוליטי על ידי פרוטאזות ליזוזומליות17.

תהליך האוטופגיה נשמר בכל האורגניזמים האיקריוטיים והוא חיוני בוויסות תנאים תוך-תאיים באמצעות תחלופה ציטופלזמית. הוא מסיר חלבונים לא מקופלים או מצטברים, מסלק פתוגנים תוך-תאיים ומנקה אברונים פגומים. מספר אברונים, כולל הרטיקולום האנדופלזמי, המיטוכונדריה, הפרוקסיזומים, הליזוזומים, הגרעין וה-LDs, דווחו כמטרות לאוטופגיה 16,18,19,20,21,22. מקורם של LDs ב-ER והם אברוני אחסון חיוניים מרכזיים להומאוסטזיס שומנים ואנרגיה. הארכיטקטורה הייחודית שלהם מורכבת מליבה הידרופובית של ליפידים ניטרליים המוקפים בשכבה חד-שכבתית פוספוליפידית המוטמעת בחלבונים ספציפיים. טיפות אלו יכולות לקיים אינטראקציה עם אברונים תאיים שונים דרך אתרי מגע ממברנה23. נוסף על כך, אוטופגיה עוזרת למחזר משאבים ראשוניים כדי לשמור על תנאים תאיים מיטביים. לדוגמה, פירוק של LDs יכול להוביל לייצור ATP באמצעות חומצות שומן β-חמצון24.

אוטופגיה קשורה למחלות שונות, כולל מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן17. אוטופגיה יכולה לקדם או לעכב את צמיחת הגידול בסרטן, בהתאם להקשר25,26. לדוגמה, עכברי Beclin 1 +/- מציגים שכיחות גבוהה של לימפומות וקרצינומות ספונטניות באיברים כמו הריאה, הכבד ורקמת החלב. לעומת זאת, אובדן הגן הקשור לאוטופגיה Atg7 בתאי אפיתל המעי מחליש את צמיחת הגידול המונעת על ידי אובדן מדכא הגידול הראשוני בסרטן המעי הגס, אדנומטי פוליפוזיס קולי (APC)27,28. לפיכך, לאובדן גנים הקשורים לאוטופגיה יכולות להיות השפעות מנוגדות על צמיחת הגידול.

תאי סרטן חייבים לייצר אנרגיה כדי לקיים את צמיחתם, חלוקתם והישרדותם29. יש להם נטייה גבוהה לשומנים, המשמשים לביוסינתזה של רכיבים מבניים וייצור אנרגיה30. תאי סרטן יכולים להתאים את חילוף החומרים שלהם לתנאי הסביבה. לדוגמה, כאשר גליקוליזה מדוכאת בתאי HeLa שמקורם בסרטן צוואר הרחם, זרחון חמצוני מוגבר כדי להשיג את ה-ATP הדרוש להישרדות31. שומנים בתא אינם קיימים כ-FFAs שאינם אסטריים בשל הציטוטוקסיות הפוטנציאלית שלהם בריכוזים גבוהים. במקום זאת, תאים מאחסנים FFAs וכולסטרול כביומולקולות ניטרליות ואינרטיות כגון אסטרי סטרול וטריגליצרידים ב-LDs32. כתוצאה מכך, ליפופגיה יכולה לתרום לחילוף החומרים של הסרטן על ידי אספקת FFAs לייצור אנרגיה, תחום מתפתח בחקר הסרטן. עם זאת, המסלולים המווסתים את חמצון FA המיטוכונדריאלי בתאי סרטן נותרו לא מובנים היטב. הוכח כי ספיגה והצטברות של FFAs משפרת את האגרסיביות של סוגי סרטן שונים 33,34,35. תכנות מחדש של חילוף החומרים של השומנים הוא סימן היכר של תכנות מחדש מטבולי של סרטן, הממלא תפקיד מרכזי כתגובה אדפטיבית לניהול תרחישים פיזיולוגיים שליליים במיקרו-סביבת הגידול36,37. ואכן, הצטברות LDs נצפתה בסוגי סרטן אנושיים רבים, כולל סרטן הריאות, השד והערמונית, והיא קשורה לאגרסיביות ופרוגנוזה קלינית גרועה 38,39,40.

בהתחשב ברלוונטיות של אוטופגיה ו-LDs במטבוליזם של סרטן והמנגנונים הלא מובנים היטב, חיוני לקבוע פרוטוקולים לחקר תרומתם להתפתחות סרטן. מחקר זה מתאר פרוטוקול להערכת ליפופגיה באמצעות רכישת הדמיה קונפוקלית ופרוטוקולי ניתוח הדמיה כמותית כדי לחקור שינויים מטבוליים של שומנים בתאים סרטניים.

Protocol

מחקר זה נערך באמצעות תאי HeLa אדנוקרצינומה אפיתל (CCL2, ATCC). הפרוטוקול מתמקד בחקר טיפות שומן (LDs) במהלך השראת ליפופגיה בתאים חיים כדי לכמת את מהלך הזמן של וריאציה של מספר LD ואינטראקציות LD-autophagosome בתאים המבטאים את סוג הבר (p62/SQSTM1-S182S) ושתי מוטציות ספציפיות לאתר של קולטן האוטופגיה p62/SQSTM116. ביטוי של צורה פגומה בפוספו (p62/SQSTM1-S182A) מגדיל את מספר ה-LDs, בעוד שביטוי של צורה מחקה פוספו (p62/SQSTM1-S182E) מפחית את מספר ה-LDs16. ראשית, מתוארת שיטה לניתוח LDs בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר מכן, מוסבר הפרוטוקול לרכישת וניתוח תמונות אוטומטיות לחלוטין ללא משוא פנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי רובוטי. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הדמיית תאים חיים קונפוקלית

  1. תרבית תאים
    1. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1,000 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ואמפוטריצין B. שמרו על התאים עד שהם מגיעים ללא יותר מ-80% מפגש.
    2. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של מי מלח 1x חוצץ פוספט, אספו באמצעות 0.25% v/v טריפסין/EDTA, וצנטריפוגה ב-100 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
    4. השעו מחדש את התאים במדיום תרבית DMEM עם 10% v/v FBS וזרעים (0.05 x 106 תאים לבאר) לכלי זכוכית 35 מ"מ.
    5. העבר את התאים באמצעות טרנספקציה TransIT-LT1 או מגיב ליפופקטמין 2000. השתמש ב-DNA פלסמיד של 1 מיקרוגרם מכל גרסאות זרחן p62/SQSTM1-mcherry ו-p62/SQSTM1-mcherry16.
    6. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 48 שעות לפני שתמשיכו בטיפולים הבאים.
      הערה: ב-16-24 שעות לאחר הטרנספקציה, p62/SQSTM1 יוצר עיבוי גדול במקום אוטופאגוזומים p62/SQSTM1 בדידים. עיבוי גדול זה מתפוגג ברובו בסימן 48 שעות, מה שמאפשר תצפית מדויקת יותר על אוטופאגוזומים.
  2. תיוג אברונים
    1. שוטפים את התאים בכלי עם תחתית זכוכית פעמיים עם 1x PBS (שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס).
    2. לדגור את התאים עם BODIPY 493/503 מדולל ל-0.5 מיקרומטר במדיום DMEM בתוספת HEPES של 10 מ"מ ולשמור למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. ניתן להשתמש גם ב-BODIPY 405 ו-BODIYPY 633 עם אותן תוצאות.
    3. בדוק שביטוי של גרסאות p62/SQSTM1 גורם לשינויים במספר ה-LDs ובעוצמת הקרינה הכוללת.
    4. שטפו את התאים עם PBS (טמפרטורת החדר) 1x ושמרו אותם ב-DMEM נטול פנולים אדומים בתוספת מאגר HEPES מוסמך ES של 10 מ"מ להדמיית תאים חיים.
      הערה: BODIPY 493/503 פולט פלואורסצנטי ירוק בוהק, מה שהופך אותו לנוח לתיוג פלואורסצנטי כפול. עם זאת, בתנאים מסוימים, כגון עירור חוזר, הוא יכול לפלוט פלואורסצנטיות אדומה, מה שעלול להוביל לפרשנויות שגויות (קולוקליזציה שגויה) בשילוב עם סמנים אדומים. למידע נוסף על פלואורופורים עירור של 550 ננומטר, עיין במאמר של Ohsaki et al.41.
  3. רכישת תמונה במיקרוסקופיה קונפוקלית בהדמיית תאים חיים
    הערה: תמונות של LDs נרכשות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת טבילה בשמן פי 63 (NA 1.4). תוכנה תואמת לרכישת תמונות שימשה לצילום התמונות. הטמפרטורה נשמרת על 37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת בקרת טמפרטורה אוטומטית.
    הערה: תמונות של טיפות שומנים (LDs) נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרת טבילה בשמן פי 63 (NA 1.4). נעשה שימוש בתוכנה תואמת לרכישת תמונות כדי ללכוד את התמונות. הטמפרטורה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת בקרת טמפרטורה אוטומטית.
    1. כוונן את לייזר גז הארגון הרב-קווי ל-10% כוח עבודה, כאשר קו הלייזר של 488 ננומטר בעוצמת עבודה של 1%-2%, וכתוצאה מכך עוצמת לייזר כוללת של 0.1%-0.2%.
    2. כדי למזער נזק לתאים ולבדוק את ההלבנה, כוונן את הלייזר 568 ננומטר לעוצמה של 3%-5%.
    3. התאם את הגדרות רכישת התמונות בתוכנה לרזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים. המערכת משתמשת בגלאי היברידי הפועל ב-600 הרץ, עם ממוצע של 2.
    4. התאם את הטווחים הספקטרליים בין 478-494 ננומטר (פליטה ירוקה עבור LDs) ואורך גל של 600-625 ננומטר (פליטה אדומה עבור mCherry).
    5. התאם את גודל חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת (AU) עבור אורך גל של 488 ננומטר.
    6. דגרו על התאים עם 8-Br-cAMP (100 מ"מ) כדי להפעיל PKA קינאז ולהגביר את פירוק ה-LDs16.
    7. צלם תמונות פלואורסצנטיות במרווחי זמן של 5 דקות, 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  4. ניתוח תמונה
    1. פתח קובץ אוסף המכיל רצפי תמונות חיות בודדים באמצעות ImageJ. השתמש במנהל החזר ההשקעה לפילוח תאים ידני. שמור אזורים לשלב הבא.
    2. פתחו את קובץ האוסף ואחזרו אזורים שנשמרו עבור כל תמונה. התאם את סף ערוץ LDs.
    3. מדוד את עוצמת הקרינה הכוללת על ידי בחירת רב מדדים במנהל החזר ה-ROI.
      הערה: במהלך אוטופגיה, עוצמת הקרינה הכוללת ומספר ה-LDs יכולים להשתנות באופן משמעותי. בנוסף, אינטראקציות בין LDs לליזוזומים גדלות במהלך אינדוקציה של אוטופגיה.
  5. ניתוח אנשי קשר ולוקליזציה משותפת
    1. בצע לכידה מולטי-ספקטרלית במרווחים של 1 שניות למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. הגדר את לייזר גז הארגון הרב-קווי לעוצמה של 10%, כאשר קו הלייזר של 488 ננומטר בכוח עבודה של 0.1%-0.5% כדי למזער נזק לתאים ולבדוק פוטוהלבנה. התאם לייזר 568 ננומטר לעוצמה של 3%-5%.
    3. לחץ על ComDet V: תוספים < ComDet V 0.5.3 < לזהות חלקיקים. הגדר את המרחק המינימלי שנקודות צריכות להיחשב כמשותפות.
    4. בחרו בפרמטרים המגדירים את החלקיק, כגון גודלו (יחידת מ"מ או פיקסלים) וסף, לשני הערוצים בנפרד. יסופק סיכום עם מספר החלקיקים בכל ערוץ עבור כל פעם ואחוז הקולוקליזציה המתאים, אותו ניתן לייצא לאקסל (ראה קובץ משלים 1).
      הערה: תוסף ComDet V מומלץ עבור אברונים בעלי צורה אליפסה, כגון טיפות שומנים, אנדוזומים, פרוקסיזומים או ליזוזומים. זה לא מומלץ לקולוקליזציה עם אברונים כמו מיטוכונדריה. התוסף "ComDet V" (הפצת ImageJ FIJI) מאפשר לנתח קולוקליזציה זמנית באמצעות ניתוח חלקיקים. כדי להתקין אותו בפיג'י, העתק את http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ ה-URL, עבור אל עזרה, עדכון, בחר נהל אתרי עדכון - הוסף אתר עדכון והדבק את כתובת האתר. החל את השינויים; מומלץ להשתמש בשני ערוצים. אם יש ערוצים נוספים, הפרד ביניהם והצטרף מחדש באמצעות מיזוג.
  6. תנועה דינמית של לקות למידה
    1. הגדר אזורי עניין (ROI) עבור חרוזים ותאים ושמור אותם. עבור אל תוספים ובחר מעקב ו- TrackMate.
    2. פתחו את TrackMate. החלון הראשון של התוסף מספק מידע על מרווחי הזמן שבהם התמונות נלכדות ורזולוציית התמונה. כדי לאשר מרווחי זמן מבלי לבצע שינויים, לחץ על הבא.
    3. בחר גלאי LoG ולאחר מכן הבא. בתצורת גלאי LoG, סנן חלקיקים לפי קוטרם, בין 0.8-1.0 מיקרון, וקבע סף מתאים. בצע תצוגה מקדימה כדי לאשר את הפרמטרים הנכונים ולחץ על הבא.
    4. הגדר את הסף ההתחלתי, סף איכות המגביל את מספר הנקודות שיש לנתח. זה נדרש כאשר עוקבים אחר נקודות רבות במישור, וזה מאתגר. אל תשתמש במסנן; לחץ על NEXT מבלי לשנות את הפרמטרים.
    5. בחר תצוגה: בחר HyperStack Displayer ולחץ על הבא.
    6. בחר גשש LAP בתנועה ליניארית עבור חלקיקים בעלי מהירות קבועה במישור.
    7. הגדר את המרחק המרבי בין שתי נקודות בעת התחלת מסלול חדש. בהתאם לתמונות, מומלץ להיות בין 0.5 -1 מיקרון.
    8. הגדר את המרחק המרבי ממיקום חזוי עבור נקודות מועמדות לניתוח.
    9. הגדר את Max Frame Gap כזמן המרבי למעקב אחר נקודה שעלולה להיעלם ממישור המוקד. אנו ממליצים על שתי נקודות זמן.
    10. בחר אפשרויות תצוגה. טבלת הסיכום, כולל מהירות מינימלית, מהירות מרבית, מהירות ממוצעת, מהירות חציונית ותזוזת מסלול, מיוצאת ל- Excel (ראה קובץ משלים 2).
    11. בחר תכונות עלילה. כדי לייצג את התוצאות באופן חזותי, עבור אל רצועות. בחר את המידה לייצוג (מהירות ותזוזה) על ציר ה-X, והכתמים ממוקמים על ציר ה-Y.
    12. בחר/י ״פעולה ״ כדי לשמור סרטונים המציגים את תנועת הכתמים. זה מאפשר הדמיה של כתמים המראים שינויים משמעותיים.
      הערה: שיפור האוטופגיה מייעל את השטף התאי ומפחית את מספר ה-LD, ומדגיש את תפקידו המכריע בוויסות חילוף החומרים ובהומאוסטזיס תאי16. התוספים שהוזכרו זמינים עבור תוכנת ImageJ (הפצת פיג'י). ניתן להשתמש גם בתוכנה מקבילה. עבור כל מדידות עוצמת הקרינה, נעשה שימוש בצפיפות הקרינה המשולבת ("RawIntDen" ב-ImageJ), המהווה את הקרינה הכוללת על פני כל פיקסל תמונה, תוך התחשבות באזור.

2. רכישת תמונות קונפוקליות אוטומטית לחלוטין וניתוח תמונה בתאים קבועים

הערה: שיטה זו מאפשרת להעריך מספר תנאים ולפתח מדידות משולשות עבור כל תנאי, לשפר את הביטחון בערכים הנמדדים הממוצעים ולאפשר קביעת סטיית תקן או שגיאת תקן להבחנה סטטיסטית בין ניסויים. זרימת העבודה של השיטה מתוארת בתרשים הזרימה המוצג באיור 1.

  1. תרבית תאים
    1. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% v/v סרום בקר עוברי (FBS), 1,000 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ואמפוטריצין B.
    2. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), שנקטף באמצעות 0.25% v/v טריפסין/EDTA.
    3. אוספים את התאים בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר ב 100 x גרם למשך 5 דקות.
    5. שאפו את הסופרנטנט בזהירות עם פיפטה ושמרו את כדור התא.
    6. השעו מחדש את גלולת התא במדיום תרבית DMEM עם 10% v/v FBS וזרע לתוך צלחות תחתונות אופטיות של 96 בארות (0.05 x 106 תאים/באר).
      הערה: התאים מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות לפני שתמשיך בטיפולים הבאים.
  2. השראת אוטופגיה על ידי הרעבה בסרום
    1. הסר את מדיום תרבית התאים ודגר את התאים במדיום DMEM נטול סרום כדי להסיר סרום ולגרום לאוטופגיה למשך 6 שעות.
    2. השתמש בבפילומיצין A1 200 ננומטר כדי לעכב ליפופגיה של LD. מעכב דיאצילגליצרול אציל טרנספראז-1 (DGAT1) T863 (50 מיקרומטר) מעכב ביוגנזה של LD. השתמש במעכב קרניטין פלמיטואיל טרנספראז I (CPT1) אטומוקסיר (100 מיקרומטר) כדי לעכב המרת FFAs לאציל-קרניטין. בנוסף, ניתן לעכב ליפוליזה באמצעות ATGLstatin (10 מיקרומטר).
  3. קיבוע תאים
    1. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS-CM קר כקרח (200 מיקרוליטר לבאר).
    2. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד מדולל ב-PBS בתוספת 0.1 מ"מ CaCl2 ו-1 מ"מ MgCl2 (PBS-CM) בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות16.
    3. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS-CM (200 מיקרוליטר לבאר).
    4. חדירה עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS-CM בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    5. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS-CM.
  4. תיוג אברונים
    1. דגרו את התאים עם BODIPY 493/503 מדולל ב-0.5 מיקרומטר ו-DAPI (125 מ"ג/מ"ל) ב-PBS-CM למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. שוטפים שלוש פעמים עם PBS-CM.
    3. שמור את התאים הקבועים והצבועים ב-200 מיקרוליטר PBS לבאר עד לרכישת התמונה.
      הערה: ניתן לאחסן את הצלחת בת 96 הבארות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות, מוגנת מפני אור והתייבשות. אין צורך בהרכבה עם אמצעי הרכבה נפוצים נגד דהייה.
  5. מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית (תאים קבועים)
    1. בצע צביעת גרעינים לפילוח תמונה אוטומטי16.
      הערה: רכישת תמונה משתמשת במיקרוסקופ דיסק מסתובב עם מטרת טבילה במים פי 40 (NA 1.1). רכישת DAPI מתבצעת באמצעות תאורת LED של 305 ננומטר (לדוגמה: 355-385 ננומטר; EM: 430-500 ננומטר), ורכישת BODIPY 493/503 מתבצעת באמצעות תאורת LED של 488 ננומטר (לדוגמה: 460-490 ננומטר; EM: 550-550 ננומטר).
  6. ניתוח תמונה
    הערה: ניתוח תמונה16 מתבצע באמצעות תוכנה תואמת עם מודול ניתוח LD ייעודי. לתוכנה ששימשה במחקר זה (ראה טבלת חומרים) יש שילוב אלגוריתמים של פתרון מוכן (RMS Lipid Droplet Analysis) לפילוח וכימות תמונה.
    1. זהה את הגרעינים על ידי בחירת ערוץ DAPI והתאם את הסף על סמך האות והרקע.
    2. זהה את הציטופלזמה. בחר את השיטה המתאימה על סמך ערוץ הקרינה של LDs.
    3. זהה כתמים על ידי התאמת פרמטרים: רדיוס (1-1.5 מיקרומטר), ניגודיות (0.2-0.25), עוצמת נקודה לאזור לא מתוקנת (0.4-0.6), מרחק (0.3-0.4 מיקרומטר), רדיוס שיא נקודתי (0.2-0.25 מיקרומטר).
    4. חישוב מאפייני מורפולוגיה: בחר LDs של אוכלוסייה, אזור נקודה ושיטה סטנדרטית , ולאחר מכן בחר אזור.
    5. חשב מאפייני עוצמה: בחר ערוץ LDs , LDs אוכלוסייה, אזור נקודה ושיטה סטנדרטית .
    6. חישוב מאפיינים: בחר את האוכלוסייה של כל התאים, בחר את השיטה לפי LDs של אוכלוסייה קשורה, ולאחר מכן בחר את מספר ה-LDs, השטח והעוצמה (ממוצע וסכום; הסכום משולב צפיפות/עוצמה פלואורסצנטית). זה יניב מדידות LD הקשורות לתא.
    7. הגדר תוצאות על ידי בחירת פלט סטנדרטי, ספירת אובייקטים, מספר LDs לתא מבוטא כממוצע ± SD, LDs ממוצעים לאזור, סה"כ LDs לאזור, שברים של LD לכל אזור ועוצמת LDs כוללת.

תוצאות

הדמיית תאים חיים קונפוקלית
LDs הם דינמיים ומקיימים אינטראקציה חולפת עם אוטופאגוזומים חיוביים p62/SQSTM1. כאשר ליפופגיה מושרת, אינטראקציות אלו מפחיתות את מספר ה-LDs ואת עוצמתם הפלואורסצנטית הכוללת. פרוטוקול זה השתמש בגרסאות פוספו-מוטנטיות של קולטן האוטופגיה p62/SQSTM1 כ?...

Discussion

טכניקות הדמיה כמותיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית ופרוטוקולי ניתוח תמונה, סיפקו תובנות חשובות לגבי הדינמיקה של LDs במהלך ליפופגיה 16,42,43. טכנולוגיות אלו מאפשרות הדמיה וכימות בזמן אמת של LDs, ומאפשרות ניתוח של מספרם, גודלם ו...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המיקרוסקופ הקונפוקלי הרובוטי של אופרטה מומן על ידי מענק N° EQM220072 של Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP). C.L. נתמך על ידי Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), מלגת הדוקטורט של אוניברסיטת סן סבסטיאן. C.S. נתמכה על ידי מלגת Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. ו-J.C. נתמכו על ידי מענק N°1221374 של Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

References

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
  2. Mejlvang, J., et al. Starvation induces rapid degradation of selective autophagy receptors by endosomal microautophagy. J Cell Biol. 217 (10), 3640-3655 (2018).
  3. Kaushik, S., Cuervo, A. M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (6), 365-381 (2018).
  4. Galluzzi, L., Pietrocola, F., Levine, B., Kroemer, G. Metabolic control of autophagy. Cell. 159 (6), 1263-1276 (2014).
  5. He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet. 43, 67-93 (2009).
  6. Suzuki, K., Ohsumi, Y. Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (pas). FEBS Lett. 584 (7), 1280-1286 (2010).
  7. Neufeld, T. P. Contribution of ATG1-dependent autophagy to tor-mediated cell growth and survival. Autophagy. 3 (5), 477-479 (2007).
  8. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of ATG proteins in autophagosome formation. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 107-132 (2011).
  9. Mari, M., et al. An ATG9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190 (6), 1005-1022 (2010).
  10. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian ATG proteins. Autophagy. 6 (6), 764-776 (2010).
  11. Kabeya, Y., et al. LC3, GABARAP AND GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-ii formation. J Cell Sci. 117 (Pt 13), 2805-2812 (2004).
  12. Ahmad, R., et al. P62/SQSTM1 binds with claudin-2 to target for selective autophagy in stressed intestinal epithelium. Commun Biol. 6 (1), 740 (2023).
  13. Bento, C. F., et al. Mammalian autophagy: How does it work. Annu Rev Biochem. 85, 685-713 (2016).
  14. Jahreiss, L., Menzies, F. M., Rubinsztein, D. C. The itinerary of autophagosomes: From peripheral formation to kiss-and-run fusion with lysosomes. Traffic. 9 (4), 574-587 (2008).
  15. Pu, J., Guardia, C. M., Keren-Kaplan, T., Bonifacino, J. S. Mechanisms and functions of lysosome positioning. J Cell Sci. 129 (23), 4329-4339 (2016).
  16. Tapia, D., et al. KDEL receptor regulates secretion by lysosome relocation- and autophagy-dependent modulation of lipid-droplet turnover. Nat Commun. 10 (1), 735 (2019).
  17. Ichimiya, T., et al. Autophagy and autophagy-related diseases: A review. Int J Mol Sci. 21 (23), 8974 (2020).
  18. Ciechanover, A. Proteolysis: From the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  19. Khaminets, A., et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature. 522 (7556), 354-358 (2015).
  20. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death Differ. 20 (1), 31-42 (2013).
  21. Koerver, L., et al. The ubiquitin-conjugating enzyme ube2ql1 coordinates lysophagy in response to endolysosomal damage. EMBO Rep. 20 (10), e48014 (2019).
  22. Deosaran, E., et al. NBR1 acts as an autophagy receptor for peroxisomes. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 939-952 (2013).
  23. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (3), 137-155 (2019).
  24. Xu, C., Fan, J. Links between autophagy and lipid droplet dynamics. J Exp Bot. 73 (9), 2848-2858 (2022).
  25. White, E. The role for autophagy in cancer. J Clin Invest. 125 (1), 42-46 (2015).
  26. Amaravadi, R. K., Kimmelman, A. C., Debnath, J. Targeting autophagy in cancer: Recent advances and future directions. Cancer Discov. 9 (9), 1167-1181 (2019).
  27. Levy, J., et al. Intestinal inhibition of ATG7 prevents tumour initiation through a microbiome-influenced immune response and suppresses tumour growth. Nat Cell Biol. 17 (8), 1062-1073 (2015).
  28. Trentesaux, C., et al. Essential role for autophagy protein ATG7 in the maintenance of intestinal stem cell integrity. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (20), 11136-11146 (2020).
  29. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (review). Oncol Lett. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  30. Martin-Perez, M., Urdiroz-Urricelqui, U., Bigas, C., Benitah, S. A. The role of lipids in cancer progression and metastasis. Cell Metab. 34 (11), 1675-1699 (2022).
  31. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9 (1), 18699 (2019).
  32. Danielli, M., Perne, L., Jarc Jovicic, E., Petan, T. Lipid droplets and polyunsaturated fatty acid trafficking: Balancing life and death. Front Cell Dev Biol. 11, 1104725 (2023).
  33. Butler, L. M., et al. Lipids and cancer: Emerging roles in pathogenesis, diagnosis and therapeutic intervention. Adv Drug Deliv Rev. 159, 245-293 (2020).
  34. Nagarajan, S. R., Butler, L. M., Hoy, A. J. The diversity and breadth of cancer cell fatty acid metabolism. Cancer Metab. 9 (1), 2 (2021).
  35. Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipids in cancer: A global view of the contribution of lipid pathways to metastatic formation and treatment resistance. Oncogenesis. 11 (1), 46 (2022).
  36. Yang, K., et al. The role of lipid metabolic reprogramming in tumor microenvironment. Theranostics. 13 (6), 1774-1808 (2023).
  37. Tan, Y., et al. Metabolic reprogramming from glycolysis to fatty acid uptake and beta-oxidation in platinum-resistant cancer cells. Nat Commun. 13 (1), 4554 (2022).
  38. Safi, R., Menendez, P., Pol, A. Lipid droplets provide metabolic flexibility for cancer progression. FEBS Lett. 598 (10), 1301-1327 (2024).
  39. Iwahashi, N., et al. Lipid droplet accumulation independently predicts poor clinical prognosis in high-grade serous ovarian carcinoma. Cancers (Basel). 13 (20), 5251 (2021).
  40. Luo, W., et al. Adding fuel to the fire: The lipid droplet and its associated proteins in cancer progression. Int J Biol Sci. 18 (16), 6020-6034 (2022).
  41. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using bodipy dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 133 (4), 477-480 (2010).
  42. Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: Regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Dev Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
  43. Nguyen, T. B., Olzmann, J. A. Lipid droplets and lipotoxicity during autophagy. Autophagy. 13 (11), 2002-2003 (2017).
  44. Giamogante, F., et al. A SPLICS reporter reveals-synuclein regulation of lysosome-mitochondria contacts which affects TFEB nuclear translocation. Nat Commun. 15 (1), 1516 (2024).
  45. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  46. Nguyen, T. B., et al. DGAT1-dependent lipid droplet biogenesis protects mitochondrial function during starvation-induced autophagy. Dev Cell. 42 (1), 9-21.e5 (2017).
  47. Murugan, S., Amaravadi, R. K. Methods for studying autophagy within the tumor microenvironment. Adv Exp Med Biol. 899, 145-166 (2016).
  48. Mallela, S. K., et al. Detection and quantification of lipid droplets in differentiated human podocytes. Methods Mol Biol. 1996, 199-206 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved