АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Липофагия – это селективная форма аутофагии, которая включает в себя деградацию липидных капель. Дисфункции в этом процессе связаны с развитием рака. Тем не менее, точные механизмы еще не до конца понятны. Этот протокол описывает подходы к количественной визуализации, чтобы лучше понять взаимодействие между аутофагией, метаболизмом липидов и прогрессированием рака.

Аннотация

Макроаутофагия, обычно называемая аутофагией, представляет собой высококонсервативный клеточный процесс, ответственный за деградацию клеточных компонентов. Этот процесс особенно заметен при таких условиях, как натощак, клеточный стресс, повреждение органелл, повреждение клеток или старение клеточных компонентов. Во время аутофагии сегмент цитоплазмы заключен в двухмембранные везикулы, известные как аутофагосомы, которые затем сливаются с лизосомами. После этого слияния содержимое аутофагосом подвергается неселективной объемной деградации, чему способствуют лизосомы. Тем не менее, аутофагия также проявляет селективную функциональность, нацеливаясь на конкретные органеллы, включая митохондрии, пероксисомы, лизосомы, ядра и липидные капли (ЛД). Липидные капли окружены фосфолипидным монослоем, который изолирует нейтральные липиды из цитоплазмы, защищая клетки от вредного воздействия избытка стеринов и свободных жирных кислот (СЖК). Аутофагия связана с различными состояниями, включая нейродегенеративные заболевания, метаболические нарушения и рак. В частности, липофагия — зависимая от аутофагии деградация липидных капель — играет решающую роль в регулировании внутриклеточных уровней СЖК в различных метаболических состояниях. Эта регуляция поддерживает такие важные процессы, как синтез мембран, формирование сигнальных молекул и энергетический баланс. Следовательно, нарушенная липофагия повышает уязвимость клеток к смертельным стимулам и способствует развитию таких заболеваний, как рак. Несмотря на свою значимость, точные механизмы, регулирующие метаболизм липидных капель, регулируемый липофагией в раковых клетках, остаются плохо изученными. Целью данной статьи является описание протоколов получения конфокальной визуализации и количественного анализа изображений, которые позволяют исследовать липофагию, связанную с метаболическими изменениями в раковых клетках. Результаты, полученные с помощью этих протоколов, могут пролить свет на сложное взаимодействие между аутофагией, метаболизмом липидов и прогрессированием рака. Выяснение этих механизмов может привести к появлению новых терапевтических мишеней для борьбы с раком и другими метаболическими заболеваниями.

Введение

Аутофагия — это общий термин, используемый для описания катаболических процессов, в которых клетка транспортирует свои компоненты в лизосому для деградации. На сегодняшний день выделено три типа аутофагии: микроаутофагия, макроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия 1,2,3. Макроаутофагия, далее именуемая аутофагией, является важным путем для регуляции клеточного гомеостаза. Нарушение этого баланса может привести к развитию патологических состояний4.

Аутофагия – это сложный процесс, который включает в себя несколько этапов. Первым шагом является индукция аутофагии, вызванная различными стимулами, такими как отмена факторов роста (инсулина и инсулиноподобных факторов роста), патогенные инфекции, снижение уровня клеточной энергии (АТФ), внеклеточный или внутриклеточный стресс (например, гипоксия, стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР), окислительный стресс) и дефицит питательных веществ (аминокислот, глюкозы)5. Второй этап включает в себя формирование фагофора, в котором инициируется выделение мембраны из ER, плазматической мембраны и митохондрий. Образование de novo включает в себя консервативный механизм цитозольных белков, которые последовательно рекрутируются6, таких как комплекс киназы Ser/Thr Unc-51-подобной киназы-1 (ULK1: ATG1 у дрожжей), Beclin-1 и VPS347. После образования комплекса ULK1 фосфатидилинозитол 3-киназа (PI3K) комплекса I класса III рекрутируется в изолированную мембрану (IM), которая функционирует при первичной секвестрации грузов8. Кроме того, комплекс ULK1 обладает способностью рекрутировать ATG9 в изоляционную мембрану (IM), что является важным шагом, поскольку везикулы ATG9 признаны мембранными носителями, способствующими расширению IM9.

Две убиквитин-подобные (Ubl) конъюгационные системы имеют решающее значение для процесса экспансии: система легкой цепи 3, ассоциированного с микротрубочками, белка 1 (LC3-I) и система ATG1210. Перед конъюгацией предшественник LC3 подвергается расщеплению. Затем цитозольный LC3-I конъюгируют с фосфатидилэтаноламином (ПЭ) с образованием мембраноассоциированного LC3-ПЭ (LC3-II), который способствует образованию аутофагосом11. В ходе этого процесса груз должен быть интернализован в формирующуюся двухмембранную аутофагосому. Аутофагия может интернализировать случайные мишени для деградации или захватывать селективные грузы через специфические рецепторы аутофагии, такие как p62/SQSTM112. Последним этапом является слияние образовавшейся аутофагосомы с лизосомами, приводящее к образованию аутолизосом. Несмотря на то, что точный механизм образования аутолизосом остается неясным, в этот процесс слияния вовлечены мембранно-связывающие комплексы, RAS-родственный GTP-связывающий белок, и белки рецепторов белка прикрепления растворимого N-этилмалеимида-чувствительного фактора (SNARE)13. Кроме того, система цитоскелета микротрубочек имеет важное значение для транспортировки зрелых аутофагосом и лизосом из случайных сайтов инициации в перинуклеарную область для образования аутолизосом 14,15,16. В аутолизосоме случайно или селективно секвестрированные грузы протеолитически разлагаются лизосомальными протеазами17.

Процесс аутофагии консервативен у всех эукариотических организмов и имеет решающее значение в регулировании внутриклеточных условий посредством цитоплазматического оборота. Он удаляет неправильно свернутые или агрегированные белки, устраняет внутриклеточные патогены, очищает поврежденные органеллы. Несколько органелл, включая эндоплазматический ретикулум, митохондрии, пероксисомы, лизосомы, ядра и LDs, были зарегистрированы как мишени аутофагии 16,18,19,20,21,22. ЛД происходят из ЭР и являются важными запасающими органеллами, занимающими центральное место в липидном и энергетическом гомеостазе. Их отличительная архитектура состоит из гидрофобного ядра нейтральных липидов, окруженного монослоем фосфолипидов, в который встроены специфические белки. Эти капли могут взаимодействовать с различными клеточными органеллами через мембранные контактные участки23. Кроме того, аутофагия помогает перерабатывать первичные ресурсы для поддержания оптимальных клеточных условий. Например, деградация LDs может привести к производству АТФ за счет β-окисления жирных кислот24.

Аутофагия связана с различными заболеваниями, включая нейродегенеративные заболевания, метаболические нарушения и рак17. Аутофагия может способствовать или подавлять рост опухоли при раке, в зависимости от контекста 25,26. Например, у мышей Beclin 1 +/- наблюдается высокая частота спонтанных лимфом и карцином в таких органах, как легкие, печень и молочная ткань. И наоборот, потеря связанного с аутофагией гена Atg7 в эпителиальных клетках кишечника замедляет рост опухоли, вызванный потерей первичного супрессора опухоли при колоректальном раке, аденоматозного полипоза коли (APC)27,28. Таким образом, потеря генов, связанных с аутофагией, может оказывать противоположное влияние на рост опухоли.

Раковые клетки должны вырабатывать энергию для поддержания своего роста, деленияи выживания. Они обладают высокой адицией к липидам, которые используются для биосинтеза структурных компонентов и производства энергии30. Раковые клетки могут адаптировать свой метаболизм к условиям окружающей среды. Например, когда гликолиз подавляется в клетках HeLa, происходящих из рака шейки матки, окислительное фосфорилирование увеличивается для получения необходимой АТФдля выживания. Липиды в клетке не существуют в виде неэтерифицированных СЖК из-за их потенциальной цитотоксичности при высоких концентрациях. Вместо этого клетки хранят СЖК и холестерин в виде нейтральных, инертных биомолекул, таких как сложные эфиры стеролов и триглицериды в LDs32. Следовательно, липофагия может способствовать метаболизму рака, поставляя СЖК для производства энергии, что является новой областью в исследованиях рака. Тем не менее, пути, которые активируют окисление митохондриальных FA в раковых клетках, остаются плохо изученными. Было показано, что поглощение и накопление СЖК усиливают агрессивность различных типов рака 33,34,35. Перепрограммирование липидного обмена является отличительной чертой метаболического перепрограммирования рака, играя ключевую роль в качестве адаптивной реакции на управление неблагоприятными физиологическими сценариями в микроокружении опухоли36,37. Действительно, накопление LDs наблюдалось при многих видах рака человека, включая рак легких, молочной железы и предстательной железы, и связано с агрессивностью и плохим клиническим прогнозом 38,39,40.

Учитывая важность аутофагии и LDs в метаболизме рака и плохо изученные механизмы, важно разработать протоколы для изучения их вклада в развитие рака. В этом исследовании описывается протокол оценки липофагии с помощью протоколов конфокальной визуализации и количественного анализа изображений для изучения метаболических изменений липидов в раковых клетках.

протокол

Данное исследование проводилось с использованием клеток эпителиальной аденокарциномы HeLa (CCL2, ATCC). Протокол сосредоточен на изучении липидных капель (ЛД) во время индукции липофагии в живых клетках для количественной оценки временного хода изменения числа ЛД и взаимодействий ЛД-аутофагосом в клетках, экспрессирующих дикий тип (p62/SQSTM1-S182S) и двух сайт-специфических мутантов рецептора аутофагии p62/SQSTM116. Экспрессия фосфодефектной формы (p62/SQSTM1-S182A) увеличивает количество ЛД, в то время как экспрессия фосфо-мимикрирующей формы (p62/SQSTM1-S182E) уменьшает количествоЛД16. Во-первых, описан метод анализа ЛД в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии. Затем объясняется протокол для непредвзятого, полностью автоматизированного получения и анализа изображений с помощью роботизированного конфокального микроскопа. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Конфокальная визуализация живых клеток

  1. Культура клеток
    1. Культивируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% v/v фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1000 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и амфотерицина B. Поддерживайте клетки до тех пор, пока они не достигнут не более 80% конфлюенции.
    2. Промойте клетки 1 мл 1x фосфатно-солевого буфера, соберите с использованием 0,25% v/v трипсина/ЭДТА и центрифугируйте при 100 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    3. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    4. Ресуспендируйте клетки в питательной среде DMEM с 10% v/v FBS и семенами (0,05 x 106 клеток/лунка) в чашки со стеклянным дном 35 мм.
    5. Трансфектируют клетки с помощью трансфекции TransIT-LT1 или реагента Lipofectamine 2000. Используйте по 1 мкг плазмидной ДНК каждого фосфо-варианта p62/SQSTM1-mcherry и p62/SQSTM1-mcherryдикого типа 16.
    6. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 ч, прежде чем приступить к последующей обработке.
      Примечание: Через 16-24 ч после трансфекции p62/SQSTM1 образует крупные конденсаты, а не дискретные аутофагосомы p62/SQSTM1. Эти крупные конденсаты в значительной степени рассеиваются к отметке 48 часов, что позволяет более точно наблюдать аутофагосомы.
  2. Маркировка органелл
    1. Дважды вымойте клетки в посуде со стеклянным дном 1x PBS (предварительно нагретым до 37 °C).
    2. Инкубировать клетки с препаратом BODIPY 493/503, разведенным до 0,5 мкМ, в среде DMEM с добавлением 10 мМ HEPES и выдерживать в течение 30 мин при 37 °C, 5%CO2. BODIPY 405 и BODIYPY 633 также можно использовать с теми же результатами.
    3. Убедитесь, что экспрессия вариантов p62/SQSTM1 индуцирует изменения в количестве LDs и общей интенсивности флуоресценции.
    4. Промойте клетки 1x PBS (комнатной температуры) и храните их в DMEM, не содержащем красных фенолов, с добавлением 10 мМ буфера HEPES, сертифицированного ES, для визуализации живых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BODIPY 493/503 излучает ярко-зеленую флуоресценцию, что делает его удобным для двойной флуоресцентной маркировки. Однако при определенных условиях, таких как повторное возбуждение, он может излучать красную флуоресценцию, что потенциально приводит к ошибочной интерпретации (ложной колокализации) в сочетании с красными маркерами. Для получения дополнительной информации о флуорофорах с возбуждением 550 нм обратитесь к статье Ohsaki et al.41.
  3. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии при визуализации живых клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения LD получены с помощью конфокального микроскопа с 63-кратным масляным иммерсионным объективом (N.A. 1.4). Для съемки изображений использовалось совместимое программное обеспечение для получения изображений. Температура поддерживается на уровне 37 °C с помощью автоматизированной системы контроля температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения липидных капель (ЛД) были получены с помощью конфокального микроскопа с 63-кратным масляным иммерсионным объективом (N.A. 1.4). Для получения изображений использовалось совместимое программное обеспечение для получения изображений. Температура поддерживалась на уровне 37 °C с помощью автоматизированной системы контроля температуры.
    1. Отрегулируйте многолинейный газовый аргоновый лазер на 10% рабочей мощности, а лазерный лазер с длиной волны 488 нм - на 1%-2% рабочей мощности, в результате чего общая мощность лазера составит 0,1%-0,2%.
    2. Чтобы свести к минимуму повреждение клеток и фотообесцвечивание зонда, отрегулируйте активность лазера с длиной волны 568 нм до 3%-5%.
    3. Настройте параметры получения изображений в программном обеспечении до разрешения 1024 x 1024 пикселей. В системе используется гибридный детектор, работающий на частоте 600 Гц, в среднем 2.
    4. Отрегулируйте спектральные диапазоны между 478-494 нм (зеленое излучение для LD) и длиной волны 600-625 нм (красное излучение для mCherry).
    5. Отрегулируйте размер отверстия на 1 единицу Эйри (AU) для длины волны 488 нм.
    6. Инкубируйте клетки с 8-Br-цАМФ (100 мМ) для активации PKA-киназы и увеличения деградации LDs16.
    7. Съемка флуоресцентных изображений с интервалом в 5 минут, при температуре 37 °C в течение 60 минут.
  4. Анализ изображений
    1. Откройте файл стека, содержащий отдельные последовательности изображений в реальном времени, с помощью ImageJ. Используйте диспетчер ROI для ручной сегментации ячеек. Сохраните регионы для следующего шага.
    2. Откройте файл стека и вспомните сохраненные области для каждого изображения. Отрегулируйте пороговое значение канала LDs.
    3. Измерьте общую интенсивность флуоресценции, выбрав «Мультимер» в менеджере ROI.
      Примечание: Во время аутофагии общая интенсивность флуоресценции и количество LD могут значительно измениться. Кроме того, взаимодействие между LDs и лизосомами увеличивается во время индукции аутофагии.
  5. Анализ контактов и колокализации
    1. Выполните мультиспектральный захват с интервалом в 1 с в течение 5 мин при 37 °C.
    2. Установите многолинейный газовый аргоновый лазер на эффективность 10%, а лазерный лазер с длиной волны 488 нм - на 0,1%-0,5% рабочей мощности, чтобы свести к минимуму повреждение клеток и фотообесцвечивание зонда. Отрегулируйте лазер с длиной волны 568 нм до 3%-5% эффективности.
    3. Нажмите на ComDet V: Плагины < ComDet V 0.5.3 < обнаружения частиц. Определите минимальное расстояние, на котором точки должны считаться колокализованными.
    4. Выберите параметры, определяющие частицу, такие как ее размер (мм или единица измерения в пикселях) и пороговое значение, для обоих каналов независимо друг от друга. Будет предоставлена сводка с количеством частиц в каждом канале для каждого времени и соответствующим процентом колокализации, который можно экспортировать в Excel (см. Дополнительный файл 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин ComDet V рекомендуется для органелл овальной формы, таких как липидные капли, эндосомы, пероксисомы или лизосомы. Он не рекомендуется для колокализации с органеллами, такими как митохондрии. Плагин "ComDet V" (дистрибутив ImageJ FIJI) позволяет анализировать временную колокализацию с помощью анализа частиц. Чтобы установить его на Фиджи, скопируйте URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/, перейдите в Справка, Обновить, выберите Управление обновлениями сайтов - Добавить сайт обновления и вставьте URL. Примените изменения; Рекомендуется использовать два канала. Если каналов больше, разделите их и объедините заново с помощью функции «Объединить».
  6. Динамическое перемещение LD
    1. Определите области интереса (ROI) для бусин и ячеек и сохраните их. Перейдите в раздел Плагины и выберите Tracking и TrackMate.
    2. Откройте TrackMate. В первом окне плагина отображается информация о временных интервалах, через которые были сделаны снимки, и разрешении изображения. Чтобы подтвердить временные интервалы без внесения изменений, нажмите на кнопку ДАЛЕЕ.
    3. Выберите детектор LoG, а затем нажмите кнопку ДАЛЕЕ. В конфигурации детектора LoG отфильтруйте частицы в соответствии с их диаметром, от 0,8-1,0 мкм, и установите соответствующий порог. Выполните предварительный просмотр, чтобы подтвердить правильные параметры, и нажмите «ДАЛЕЕ».
    4. Установите начальный порог, порог качества, который ограничивает количество точек для анализа. Это требуется при следовании за большим количеством точек на самолете, что является сложной задачей. Не используйте фильтр; нажмите NEXT без изменения параметров.
    5. Выберите вид: выберите HyperStack Displayer и нажмите «ДАЛЕЕ».
    6. Выберите трекер Linear motion LAP для частиц с постоянной скоростью в плоскости.
    7. Определите максимальное расстояние между двумя точками при запуске нового трека. В зависимости от изображений, предполагается, что он составляет от 0,5 до 1 микрона.
    8. Установите максимальное расстояние от прогнозируемого положения для потенциальных точек для анализа.
    9. Установите Максимальный зазор между кадрами в качестве максимального времени следования за пятном, которое может исчезнуть из фокальной плоскости. Мы рекомендуем две временные точки.
    10. Выберите «Параметры отображения». Сводная таблица, включающая минимальную скорость, максимальную скорость, среднюю скорость, среднюю скорость и смещение гусениц, экспортируется в Excel (см. Дополнительный файл 2).
    11. Выберите Особенности участка. Чтобы представить результаты визуально, перейдите в раздел Треки. Выберите меру для представления (скорость и смещение) по оси X, а пятна будут размещены по оси Y.
    12. Выберите Действие , чтобы сохранить видео, показывающие движение пятен. Это позволяет визуализировать пятна, которые показывают значительные изменения.
      Примечание: Усиление аутофагии оптимизирует клеточный поток и снижает количество LD, подчеркивая ее решающую роль в метаболической регуляции и клеточном гомеостазе16. Упомянутые плагины доступны для программного обеспечения ImageJ (дистрибутив FIJI). Также можно использовать аналогичное программное обеспечение. Для всех измерений интенсивности флуоресценции использовалась интегральная плотность флуоресценции («RawIntDen» в ImageJ), которая учитывает общую флуоресценцию по каждому пикселю изображения с учетом площади.

2. Полностью автоматизированный получение конфокальных изображений и анализ изображений в фиксированных ячейках

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет оценить несколько условий и разработать тройные измерения для каждого условия, повышая достоверность средних измеренных значений и позволяя определять стандартное отклонение или стандартную ошибку для статистической дифференциации между экспериментами. Рабочий процесс метода показан на блок-схеме, показанной на рисунке 1.

  1. Клеточная культура
    1. Культивируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% v/v фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1000 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и амфотерицина B.
    2. Промойте клетки 1 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), собранного с использованием 0,25% v/v трипсина/ЭДТА.
    3. Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    4. Центрифугируйте клетки при комнатной температуре при 100 х г в течение 5 минут.
    5. Осторожно отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки и сохраните клеточную гранулу.
    6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в культуральной среде DMEM с 10% v/v FBS и затравите в 96-луночные планшеты с оптическим дном (0,05 x 106 клеток/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки инкубируют при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч перед последующей обработкой.
  2. Индукция аутофагии путем сывороточного голодания
    1. Удалите среду для культивирования клеток и инкубируйте клетки в лишенной сыворотки среде DMEM для удаления сыворотки и индуцирования аутофагии в течение 6 ч.
    2. Используйте бафиломицин А1 в дозе 200 нМ для ингибирования липофагии ЛД. Ингибитор диацилглицеролацилтрансферазы-1 (DGAT1) T863 (50 мкМ) ингибирует биогенез ЛД. Используйте ингибитор карнитин-пальмитоилтрансферазы I (CPT1) Этомоксир (100 мкМ) для ингибирования превращения СЖК в ацилкарнитин. Кроме того, липолиз можно ингибировать с помощью ATGLstatin (10 мкМ).
  3. Фиксация клеток
    1. Трижды промойте клетки ледяным PBS-CM (200 μл/лунка).
    2. Фиксируют клетки 4% параформальдегидом, разведенным в PBS с добавлением 0,1 мМ CaCl2 и 1 мМ MgCl2 (PBS-CM) при комнатной температуре в течение 15 мин16.
    3. Трижды промойте ячейки PBS-CM (200 μл/лунка).
    4. Растворить 0,2% Triton X-100 в PBS-CM при комнатной температуре в течение 15 минут.
    5. Трижды промыть клетки с помощью PBS-CM.
  4. Маркировка органелл
    1. Инкубируйте клетки с BODIPY 493/503, разведенным при 0,5 мкМ и DAPI (125 мг/мл) в PBS-CM в течение 30 мин при 37 °C.
    2. Трижды промыть с помощью PBS-CM.
    3. Храните неподвижные и окрашенные элементы в 200 мкл PBS на лунку до получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 96-луночный планшет можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель, защищенный от света и обезвоживания. Монтаж с помощью обычно используемых монтажных носителей с защитой от выцветания не требуется.
  5. Автоматизированная конфокальная микроскопия (неподвижные клетки)
    1. Выполнение окрашивания ядер для автоматической сегментации изображений16.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений используется микроскоп с вращающимся диском и 40-кратным (N.A 1.1) объективом для погружения в воду. Сбор данных DAPI осуществляется с помощью светодиодной подсветки с длиной волны 305 нм (Ex: 355-385 нм; Em: 430-500 нм), а BODIPY 493/503 сбор данных осуществляется с помощью светодиодной подсветки с длиной волны 488 нм (Ex: 460-490 нм; Em: 550-550 нм).
  6. Анализ изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ изображений16 выполняется с использованием совместимого программного обеспечения со специальным модулем анализа LD. Программное обеспечение, используемое в данном исследовании (см. Таблицу материалов), имеет готовое решение (RMS Lipid Droplet Analysis) для алгоритма сегментации и количественной оценки изображений.
    1. Определите ядра, выбрав канал DAPI , и отрегулируйте порог на основе сигнала и фона.
    2. Определите цитоплазму. Выберите подходящий метод на основе флуоресцентного канала LDs.
    3. Определите пятна путем регулировки параметров: Радиус (1-1,5 мкм), Контраст (0,2-0,25), Интенсивность нескорректированного пятна к области (0,4-0,6), Расстояние (0,3-0,4 мкм), Радиус пика пятна (0,2-0,25 мкм).
    4. Вычисление морфологических свойств: выберите популяционные LDs, Region Spot и стандартный метод, затем выберите Area.
    5. Вычисление свойств интенсивности: выбор канала LDs , популяционных LDs, точки региона и стандартного метода.
    6. Вычисление свойств: выберите Популяция всех ячеек, выберите метод по связанным популяционным LD, а затем выберите количество LD, площадь и интенсивность (среднее и сумма; сумма представляет собой интегрированную плотность/интенсивность флуоресценции). Это позволит получить измерения LD, связанные с клеткой.
    7. Определите результаты, выбрав Стандартный выход, Количество объектов, Количество LD на ячейку, выраженное как среднее значение ± SD, Среднее количество LD на область, Общее количество LD на область, Доли LD на область и Общая интенсивность LDs.

Результаты

Конфокальная визуализация живых клеток
ЛД динамичны и временно взаимодействуют с p62/SQSTM1-положительными аутофагосомами. Когда липофагия индуцируется, эти взаимодействия уменьшают количество LD и их общую интенсивность флуоресценции. В этом протоколе испол...

Обсуждение

Методы количественной визуализации, такие как конфокальная микроскопия и протоколы анализа изображений, предоставили ценную информацию о динамике LD во время липофагии 16,42,43. Эти технологии позволяют визуализироват?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Роботизированный конфокальный микроскоп Operetta был профинансирован грантом Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072. К.Л. был поддержан Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), стипендией доктора философии Университета Сан-Себастьяна. C.S. был поддержан стипендией Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. и J.C. были поддержаны грантом Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

Ссылки

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
  2. Mejlvang, J., et al. Starvation induces rapid degradation of selective autophagy receptors by endosomal microautophagy. J Cell Biol. 217 (10), 3640-3655 (2018).
  3. Kaushik, S., Cuervo, A. M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (6), 365-381 (2018).
  4. Galluzzi, L., Pietrocola, F., Levine, B., Kroemer, G. Metabolic control of autophagy. Cell. 159 (6), 1263-1276 (2014).
  5. He, C., Klionsky, D. J. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet. 43, 67-93 (2009).
  6. Suzuki, K., Ohsumi, Y. Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (pas). FEBS Lett. 584 (7), 1280-1286 (2010).
  7. Neufeld, T. P. Contribution of ATG1-dependent autophagy to tor-mediated cell growth and survival. Autophagy. 3 (5), 477-479 (2007).
  8. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of ATG proteins in autophagosome formation. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 107-132 (2011).
  9. Mari, M., et al. An ATG9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190 (6), 1005-1022 (2010).
  10. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian ATG proteins. Autophagy. 6 (6), 764-776 (2010).
  11. Kabeya, Y., et al. LC3, GABARAP AND GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-ii formation. J Cell Sci. 117 (Pt 13), 2805-2812 (2004).
  12. Ahmad, R., et al. P62/SQSTM1 binds with claudin-2 to target for selective autophagy in stressed intestinal epithelium. Commun Biol. 6 (1), 740 (2023).
  13. Bento, C. F., et al. Mammalian autophagy: How does it work. Annu Rev Biochem. 85, 685-713 (2016).
  14. Jahreiss, L., Menzies, F. M., Rubinsztein, D. C. The itinerary of autophagosomes: From peripheral formation to kiss-and-run fusion with lysosomes. Traffic. 9 (4), 574-587 (2008).
  15. Pu, J., Guardia, C. M., Keren-Kaplan, T., Bonifacino, J. S. Mechanisms and functions of lysosome positioning. J Cell Sci. 129 (23), 4329-4339 (2016).
  16. Tapia, D., et al. KDEL receptor regulates secretion by lysosome relocation- and autophagy-dependent modulation of lipid-droplet turnover. Nat Commun. 10 (1), 735 (2019).
  17. Ichimiya, T., et al. Autophagy and autophagy-related diseases: A review. Int J Mol Sci. 21 (23), 8974 (2020).
  18. Ciechanover, A. Proteolysis: From the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  19. Khaminets, A., et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy. Nature. 522 (7556), 354-358 (2015).
  20. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death Differ. 20 (1), 31-42 (2013).
  21. Koerver, L., et al. The ubiquitin-conjugating enzyme ube2ql1 coordinates lysophagy in response to endolysosomal damage. EMBO Rep. 20 (10), e48014 (2019).
  22. Deosaran, E., et al. NBR1 acts as an autophagy receptor for peroxisomes. J Cell Sci. 126 (Pt 4), 939-952 (2013).
  23. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (3), 137-155 (2019).
  24. Xu, C., Fan, J. Links between autophagy and lipid droplet dynamics. J Exp Bot. 73 (9), 2848-2858 (2022).
  25. White, E. The role for autophagy in cancer. J Clin Invest. 125 (1), 42-46 (2015).
  26. Amaravadi, R. K., Kimmelman, A. C., Debnath, J. Targeting autophagy in cancer: Recent advances and future directions. Cancer Discov. 9 (9), 1167-1181 (2019).
  27. Levy, J., et al. Intestinal inhibition of ATG7 prevents tumour initiation through a microbiome-influenced immune response and suppresses tumour growth. Nat Cell Biol. 17 (8), 1062-1073 (2015).
  28. Trentesaux, C., et al. Essential role for autophagy protein ATG7 in the maintenance of intestinal stem cell integrity. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (20), 11136-11146 (2020).
  29. Zheng, J. Energy metabolism of cancer: Glycolysis versus oxidative phosphorylation (review). Oncol Lett. 4 (6), 1151-1157 (2012).
  30. Martin-Perez, M., Urdiroz-Urricelqui, U., Bigas, C., Benitah, S. A. The role of lipids in cancer progression and metastasis. Cell Metab. 34 (11), 1675-1699 (2022).
  31. Shiratori, R., et al. Glycolytic suppression dramatically changes the intracellular metabolic profile of multiple cancer cell lines in a mitochondrial metabolism-dependent manner. Sci Rep. 9 (1), 18699 (2019).
  32. Danielli, M., Perne, L., Jarc Jovicic, E., Petan, T. Lipid droplets and polyunsaturated fatty acid trafficking: Balancing life and death. Front Cell Dev Biol. 11, 1104725 (2023).
  33. Butler, L. M., et al. Lipids and cancer: Emerging roles in pathogenesis, diagnosis and therapeutic intervention. Adv Drug Deliv Rev. 159, 245-293 (2020).
  34. Nagarajan, S. R., Butler, L. M., Hoy, A. J. The diversity and breadth of cancer cell fatty acid metabolism. Cancer Metab. 9 (1), 2 (2021).
  35. Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipids in cancer: A global view of the contribution of lipid pathways to metastatic formation and treatment resistance. Oncogenesis. 11 (1), 46 (2022).
  36. Yang, K., et al. The role of lipid metabolic reprogramming in tumor microenvironment. Theranostics. 13 (6), 1774-1808 (2023).
  37. Tan, Y., et al. Metabolic reprogramming from glycolysis to fatty acid uptake and beta-oxidation in platinum-resistant cancer cells. Nat Commun. 13 (1), 4554 (2022).
  38. Safi, R., Menendez, P., Pol, A. Lipid droplets provide metabolic flexibility for cancer progression. FEBS Lett. 598 (10), 1301-1327 (2024).
  39. Iwahashi, N., et al. Lipid droplet accumulation independently predicts poor clinical prognosis in high-grade serous ovarian carcinoma. Cancers (Basel). 13 (20), 5251 (2021).
  40. Luo, W., et al. Adding fuel to the fire: The lipid droplet and its associated proteins in cancer progression. Int J Biol Sci. 18 (16), 6020-6034 (2022).
  41. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using bodipy dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochem Cell Biol. 133 (4), 477-480 (2010).
  42. Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: Regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Dev Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
  43. Nguyen, T. B., Olzmann, J. A. Lipid droplets and lipotoxicity during autophagy. Autophagy. 13 (11), 2002-2003 (2017).
  44. Giamogante, F., et al. A SPLICS reporter reveals-synuclein regulation of lysosome-mitochondria contacts which affects TFEB nuclear translocation. Nat Commun. 15 (1), 1516 (2024).
  45. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: A selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
  46. Nguyen, T. B., et al. DGAT1-dependent lipid droplet biogenesis protects mitochondrial function during starvation-induced autophagy. Dev Cell. 42 (1), 9-21.e5 (2017).
  47. Murugan, S., Amaravadi, R. K. Methods for studying autophagy within the tumor microenvironment. Adv Exp Med Biol. 899, 145-166 (2016).
  48. Mallela, S. K., et al. Detection and quantification of lipid droplets in differentiated human podocytes. Methods Mol Biol. 1996, 199-206 (1996).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены