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Resumo

A lipofagia é uma forma seletiva de autofagia que envolve a degradação de gotículas lipídicas. Disfunções nesse processo estão associadas ao desenvolvimento do câncer. No entanto, os mecanismos precisos ainda não são totalmente compreendidos. Este protocolo descreve abordagens quantitativas de imagem para entender melhor a interação entre autofagia, metabolismo lipídico e progressão do câncer.

Resumo

A macroautofagia, comumente referida como autofagia, é um processo celular altamente conservado responsável pela degradação dos componentes celulares. Este processo é particularmente proeminente em condições como jejum, estresse celular, danos às organelas, danos celulares ou envelhecimento dos componentes celulares. Durante a autofagia, um segmento do citoplasma é encerrado dentro de vesículas de membrana dupla conhecidas como autofagossomos, que então se fundem com os lisossomos. Após essa fusão, o conteúdo dos autofagossomos sofre degradação não seletiva em massa facilitada pelos lisossomos. No entanto, a autofagia também exibe funcionalidade seletiva, visando organelas específicas, incluindo mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos, núcleos e gotículas lipídicas (LDs). As gotículas lipídicas são envolvidas por uma monocamada de fosfolipídios que isola os lipídios neutros do citoplasma, protegendo as células dos efeitos nocivos do excesso de esteróis e ácidos graxos livres (AGL). A autofagia está implicada em várias condições, incluindo doenças neurodegenerativas, distúrbios metabólicos e câncer. Especificamente, a lipofagia - a degradação dependente da autofagia de gotículas lipídicas - desempenha um papel crucial na regulação dos níveis intracelulares de FFA em diferentes estados metabólicos. Essa regulação suporta processos essenciais, como síntese de membrana, formação de moléculas de sinalização e balanço de energia. Consequentemente, a lipofagia prejudicada aumenta a vulnerabilidade celular a estímulos de morte e contribui para o desenvolvimento de doenças como o câncer. Apesar de sua importância, os mecanismos precisos que governam o metabolismo das gotículas lipídicas reguladas pela lipofagia em células cancerígenas permanecem pouco compreendidos. Este artigo tem como objetivo descrever protocolos de aquisição de imagens confocais e análise quantitativa de imagens que possibilitam a investigação de lipofagias associadas a alterações metabólicas em células cancerígenas. Os resultados obtidos por meio desses protocolos podem lançar luz sobre a intrincada interação entre autofagia, metabolismo lipídico e progressão do câncer. Ao elucidar esses mecanismos, novos alvos terapêuticos podem surgir para combater o câncer e outras doenças metabólicas.

Introdução

Autofagia é um termo geral usado para descrever processos catabólicos nos quais a célula transporta seus componentes para o lisossomo para degradação. Até o momento, três tipos de autofagia foram identificados: microautofagia, macroautofagia e autofagia mediada por chaperonas 1,2,3. A macroautofagia, doravante denominada autofagia, é uma via essencial para regular a homeostase celular. A ruptura desse equilíbrio pode levar ao desenvolvimento de condições patológicas4.

A autofagia é um processo complexo que envolve várias etapas. O primeiro passo é a indução da autofagia, desencadeada por vários estímulos, como a retirada de fatores de crescimento (insulina e fatores de crescimento semelhantes à insulina), infecções patogênicas, redução dos níveis de energia celular (ATP), estresse extracelular ou intracelular (por exemplo, hipóxia, estresse do retículo endoplasmático (RE), estresse oxidativo) e deficiência de nutrientes (aminoácidos, glicose)5. A segunda etapa envolve a formação do fagóforo, onde o isolamento da membrana é iniciado a partir do RE, da membrana plasmática e das mitocôndrias. A formação de novo envolve a maquinaria conservada de proteínas citosólicas que são recrutadas sequencialmente6, como o complexo Ser/Thr quinase Unc-51-like kinase-1 (ULK1: ATG1 em levedura), Beclin-1 e VPS347. Após a formação do complexo ULK1, o complexo I da fosfatidilinositol 3-quinase classe III (PI3K) é recrutado para a membrana isolada (IM), que funciona no sequestro inicial das cargas8. Além disso, o complexo ULK1 tem a capacidade de recrutar ATG9 para a membrana de isolamento (IM), uma etapa essencial, uma vez que as vesículas ATG9 são reconhecidas como portadoras de membrana que facilitam a expansão IM9.

Dois sistemas de conjugação semelhantes à ubiquitina (Ubl) são críticos para o processo de expansão: o sistema de cadeia leve 3 da proteína 1 associada aos microtúbulos (LC3-I) e o sistema ATG1210. Antes da conjugação, o precursor LC3 sofre clivagem. A LC3-I citosólica é então conjugada à fosfatidiletanolamina (PE) para produzir a LC3-PE associada à membrana (LC3-II), o que facilita a formação de autofagossomos11. A carga deve ser internalizada no autofagossomo de membrana dupla em formação durante este processo. A autofagia pode internalizar alvos aleatórios para degradação ou capturar cargas seletivas por meio de receptores específicos de autofagia, como p62 / SQSTM112. A última etapa é a fusão do autofagossomo formado com os lisossomos, levando à formação do autolisossomo. Embora o mecanismo preciso para a formação de autolisossomos permaneça indefinido, complexos de amarração de membrana, a proteína de ligação ao GTP relacionada ao RAS e as proteínas solúveis N-etilmaleimida-sensível ao fator de ligação (SNARE) estão envolvidas neste processode fusão 13. Além disso, o sistema de citoesqueleto de microtúbulos é essencial para o tráfego de autofagossomos e lisossomos maduros de locais de iniciação aleatórios em direção à área perinuclear para a formação de autolisossomos14 , 15 , 16 . No autolisossomo, as cargas sequestradas aleatoriamente ou seletivamente são degradadas proteoliticamente por proteases lisossômicas17.

O processo de autofagia é conservado em todos os organismos eucarióticos e é crucial na regulação das condições intracelulares por meio da renovação citoplasmática. Ele remove proteínas mal dobradas ou agregadas, elimina patógenos intracelulares e limpa organelas danificadas. Várias organelas, incluindo o retículo endoplasmático, mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos, núcleo e LDs, foram relatadas como alvos de autofagia 16,18,19,20,21,22. Os LDs se originam do RE e são organelas de armazenamento essenciais centrais para a homeostase lipídica e energética. Sua arquitetura distinta consiste em um núcleo hidrofóbico de lipídios neutros envolto por uma monocamada de fosfolipídios incorporada a proteínas específicas. Essas gotículas podem interagir com várias organelas celulares por meio de locais de contato com a membrana23. Além disso, a autofagia ajuda a reciclar recursos primários para manter as condições celulares ideais. Por exemplo, a degradação de LDs pode levar à produção de ATP por meio da oxidação β de ácidos graxos24.

A autofagia está associada a várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, distúrbios metabólicos e câncer17. A autofagia pode promover ou inibir o crescimento tumoral no câncer, dependendo do contexto25,26. Por exemplo, os camundongos Beclin 1 +/- exibem uma alta incidência de linfomas espontâneos e carcinomas em órgãos como pulmão, fígado e tecido mamário. Por outro lado, a perda do gene Atg7 relacionado à autofagia nas células epiteliais intestinais atenua o crescimento tumoral impulsionado pela perda do supressor tumoral primário no câncer colorretal, a polipose adenomatosa do cólon (APC)27,28. Assim, a perda de genes relacionados à autofagia pode ter efeitos opostos no crescimento do tumor.

As células cancerígenas devem produzir energia para sustentar seu crescimento, divisão e sobrevivência29. Possuem alta avidez por lipídios, que são utilizados para a biossíntese de componentes estruturais e produção de energia30. As células cancerígenas podem adaptar seu metabolismo às condições ambientais. Por exemplo, quando a glicólise é suprimida em células HeLa derivadas do câncer do colo do útero, a fosforilação oxidativa é aumentada para obter o ATP necessário para a sobrevivência31. Os lipídios em uma célula não existem como FFAs não esterificados devido à sua potencial citotoxicidade em altas concentrações. Em vez disso, as células armazenam FFAs e colesterol como biomoléculas neutras e inertes, como ésteres de esteróis e triglicerídeos em LDs32. Consequentemente, a lipofagia pode contribuir para o metabolismo do câncer, fornecendo AGLs para produzir energia, um campo emergente na pesquisa do câncer. No entanto, as vias que regulam positivamente a oxidação mitocondrial de FA em células cancerígenas permanecem pouco compreendidas. A captação e o acúmulo de AGLs demonstraram aumentar a agressividade de diferentes tipos de câncer 33,34,35. A reprogramação do metabolismo lipídico é uma marca registrada da reprogramação metabólica do câncer, desempenhando um papel fundamental como uma resposta adaptativa para gerenciar cenários fisiológicos adversos no microambiente tumoral36,37. De fato, o acúmulo de DLs foi observado em muitos cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão, mama e próstata, e está associado à agressividade e ao mau prognóstico clínico 38,39,40.

Dada a relevância da autofagia e dos LDs no metabolismo do câncer e os mecanismos pouco compreendidos, é essencial estabelecer protocolos para estudar sua contribuição para o desenvolvimento do câncer. Este estudo descreve um protocolo para avaliar a lipofagia por meio de protocolos de aquisição de imagens confocais e análise quantitativa de imagens para investigar alterações metabólicas lipídicas em células cancerígenas.

Protocolo

Este estudo foi realizado usando células HeLa de adenocarcinoma epitelial (CCL2, ATCC). O protocolo se concentra no estudo de gotículas lipídicas (LDs) durante a indução de lipofagia em células vivas para quantificar o curso do tempo de variação do número de LD e interações LD-autofagossomo em células que expressam o tipo selvagem (p62 / SQSTM1-S182S) e dois mutantes específicos do local do receptor de autofagia p62 / SQSTM116. A expressão de uma forma fosfo-defeituosa (p62 / SQSTM1-S182A) aumenta o número de LDs, enquanto a expressão de uma forma fosfo-imitadora (p62 / SQSTM1-S182E) reduz o número de LDs16. Primeiro, é descrito um método para analisar LDs em células vivas usando microscopia confocal. Em seguida, o protocolo para aquisição e análise de imagens imparciais e totalmente automatizadas é explicado usando um microscópio confocal robotizado. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Imagem confocal de células vivas

  1. Cultura de células
    1. Cultive as células a 37 ° C e 5% de CO2 em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% v / v de soro fetal bovino (FBS), 1.000 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e anfotericina B. Mantenha as células até que não atinjam mais de 80% de confluência.
    2. Lave as células com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato, colete com tripsina / EDTA a 0,25% v / v e centrifugue a 100 x g por 5 min em temperatura ambiente.
    3. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta.
    4. Ressuspenda as células em meio de cultura DMEM com 10% v / v FBS e sementes (0,05 x 106 células / poço) em placas com fundo de vidro de 35 mm.
    5. Transfecte as células usando a transfecção TransIT-LT1 ou o reagente Lipofectamine 2000. Use 1 μg de DNA de plasmídeo de cada variante fosfo-p62 / SQSTM1-mcherry e p62 / SQSTM1-mcherry16 do tipo selvagem.
    6. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 h antes de prosseguir com os tratamentos subsequentes.
      NOTA: Às 16-24 h após a transfecção, p62 / SQSTM1 forma grandes condensados em vez de autofagossomos discretos de p62 / SQSTM1. Esses grandes condensados se dissipam em grande parte na marca de 48 horas, permitindo uma observação mais precisa dos autofagossomos.
  2. Rotulagem de organelas
    1. Lave as células em um prato com fundo de vidro duas vezes com 1x PBS (pré-aquecido a 37 ° C).
    2. Incubar as células com BODIPY 493/503 diluído a 0,5 μM em meio DMEM suplementado com HEPES 10 mM e manter por 30 min a 37 °C, 5% CO2. BODIPY 405 e BODIYPY 633 também podem ser usados com os mesmos resultados.
    3. Verifique se a expressão das variantes p62/SQSTM1 induz alterações no número de LDs e na intensidade total da fluorescência.
    4. Lave as células com 1x PBS (temperatura ambiente) e mantenha-as em DMEM livre de fenol vermelho suplementado com tampão HEPES qualificado para ES de 10 mM para imagens de células vivas.
      NOTA: BODIPY 493/503 emite fluorescência verde brilhante, tornando-o conveniente para rotulagem de fluorescência dupla. No entanto, sob certas condições, como excitação repetida, pode emitir fluorescência vermelha, potencialmente levando a interpretações errôneas (falsa colocalização) quando combinado com marcadores vermelhos. Para obter mais informações sobre fluoróforos de excitação de 550 nm, consulte o artigo de Ohsaki et al.41.
  3. Aquisição de imagens por microscopia confocal em imagens de células vivas
    NOTA: As imagens de LDs são adquiridas usando um microscópio confocal com uma objetiva de imersão em óleo de 63x (NA 1.4). Um software de aquisição de imagem compatível foi usado para capturar as imagens. A temperatura é mantida a 37 °C usando um sistema automatizado de controle de temperatura.
    NOTA: Imagens de gotículas lipídicas (LDs) foram adquiridas usando um microscópio confocal com uma objetiva de imersão em óleo de 63x (N.A. 1.4). Software de aquisição de imagem compatível foi usado para capturar as imagens. A temperatura foi mantida a 37 °C usando um sistema automatizado de controle de temperatura.
    1. Ajuste o laser de gás argônio multilinha para 10% da potência de trabalho, com a linha de laser de 488 nm com potência de trabalho de 1% a 2%, resultando em uma potência geral do laser de 0,1% a 0,2%.
    2. Para minimizar os danos às células e o fotobranqueamento da sonda, ajuste o laser de 568 nm para uma potência de 3% a 5%.
    3. Ajuste as configurações de aquisição de imagem no software para uma resolução de 1024 x 1024 pixels. O sistema usa um detector híbrido operando a 600 Hz, com uma média de 2.
    4. Ajuste as faixas espectrais entre 478-494 nm (emissão verde para LDs) e comprimento de onda de 600-625 nm (emissão vermelha para mCherry).
    5. Ajuste o tamanho do orifício para 1 Airy Unit (AU) para comprimento de onda de 488 nm.
    6. Incubar as células com 8-Br-cAMP (100 mM) para ativar a PKA quinase e aumentar a degradação de LDs16.
    7. Capture imagens fluorescentes em intervalos de 5 minutos, 37 ° C por 60 minutos.
  4. Análise de imagem
    1. Abra um arquivo de pilha contendo sequências de imagens ao vivo individuais usando ImageJ. Use o gerenciador de ROI para segmentação manual de células. Salve regiões para a próxima etapa.
    2. Abra o arquivo de pilha e recupere as regiões salvas para cada imagem. Ajuste o limite do canal LDs.
    3. Meça a intensidade total da fluorescência selecionando várias medidas no gerenciador de ROI.
      NOTA: Durante a autofagia, a intensidade total da fluorescência e o número de LDs podem mudar significativamente. Além disso, as interações entre LDs e lisossomos aumentam durante a indução da autofagia.
  5. Análise de contatos e colocalização
    1. Efectuar uma captura multiespectral em intervalos de 1 s durante 5 min a 37 °C.
    2. Defina o laser de gás argônio multilinha para 10% de potência, com a linha de laser de 488 nm com 0,1% -0,5% de potência de trabalho para minimizar os danos às células e o fotobranqueamento da sonda. Ajuste o laser de 568 nm para 3% -5% de potência.
    3. Clique em ComDet V: Plugins < ComDet V 0.5.3 < Detectar partículas. Defina a distância mínima que os pontos devem ter para serem considerados colocalizados.
    4. Escolha os parâmetros que definem a partícula, como seu tamanho (unidade de mm ou pixels) e limite, para ambos os canais de forma independente. Será fornecido um resumo com o número de partículas em cada canal para cada vez e a porcentagem de colocalização correspondente, que pode ser exportada para o Excel (consulte o Arquivo Suplementar 1).
      NOTA: O plug-in ComDet V é recomendado para organelas com formato oval, como gotículas lipídicas, endossomos, peroxissomos ou lisossomos. Não é recomendado para colocalização com organelas como mitocôndrias. O plugin "ComDet V" (distribuição ImageJ FIJI) permite que a colocalização temporal seja analisada por meio da análise de partículas. Para instalá-lo em Fiji, copie o http://sites.imagej.net/Ekatrukha/ de URL, vá para Ajuda, Atualizar, selecione Gerenciar sites de atualização - Adicionar site de atualização e cole o URL. Aplique as alterações; Recomenda-se usar dois canais. Se houver mais canais, separe-os e junte-os novamente usando Mesclar.
  6. Movimento dinâmico de LDs
    1. Defina regiões de interesse (ROIs) para contas e células e salve-as. Vá para plugins e selecione Tracking e TrackMate.
    2. Abra o TrackMate. A primeira janela do plug-in fornece informações sobre os intervalos de tempo em que as imagens são capturadas e a resolução da imagem. Para confirmar os intervalos de tempo sem fazer alterações, clique em para a frente.
    3. Selecione Detector LoG e depois para a frente. Na configuração do detector LoG, filtre as partículas de acordo com seu diâmetro, de 0,8 a 1,0 mícrons, e defina um limite apropriado. Execute uma visualização para confirmar os parâmetros adequados e clique em PRÓXIMO.
    4. Defina o Limite inicial, um limite de qualidade que limita o número de pontos a serem analisados. Isso é necessário ao seguir muitos pontos no avião, o que é um desafio. Não use o filtro; pressione NEXT sem alterar os parâmetros.
    5. Selecione uma visualização: Escolha HyperStack Displayer e clique em PRÓXIMO.
    6. Selecione Rastreador LAP de movimento linear para partículas com velocidade constante no plano.
    7. Defina a distância máxima entre dois pontos ao iniciar uma nova pista. Dependendo das imagens, sugere-se que esteja entre 0,5 -1 mícron.
    8. Defina a distância máxima de uma posição prevista para pontos candidatos para análise.
    9. Defina Max Frame Gap como o tempo máximo para seguir um ponto que pode desaparecer do plano focal. Recomendamos dois pontos de tempo.
    10. Selecione Opções de exibição. A tabela de resumo, incluindo velocidade mínima, velocidade máxima, velocidade média, velocidade mediana e deslocamento da via, é exportada para o Excel (consulte o Arquivo Suplementar 2).
    11. Selecione Feições de plotagem. Para representar os resultados visualmente, vá para Faixas. Selecione a medida a ser representada (velocidade e deslocamento) no eixo X e os pontos são colocados no eixo Y.
    12. Selecione uma ação para salvar vídeos que mostram o movimento dos pontos. Isso permite a visualização de manchas que mostram mudanças significativas.
      NOTA: O aumento da autofagia otimiza o fluxo celular e reduz o número de LD, destacando seu papel crucial na regulação metabólica e na homeostase celular16. Os plugins mencionados estão disponíveis para o software ImageJ (distribuição FIJI). Software equivalente também pode ser usado. Para todas as medições de intensidade de fluorescência, foi utilizada a densidade de fluorescência integrada ("RawIntDen" em ImageJ), que contabiliza a fluorescência total em cada pixel da imagem, levando em consideração a área.

2. Aquisição de imagens confocais totalmente automatizada e análise de imagens em células fixas

NOTA: Este método permite avaliar várias condições e desenvolver medições triplicadas para cada condição, melhorando a confiança nos valores médios medidos e permitindo a determinação do desvio padrão ou erro padrão para diferenciação estatística entre experimentos. O fluxo de trabalho do método é representado no fluxograma mostrado na Figura 1.

  1. Cultura de células
    1. Cultivar as células a 37 °C e 5% de CO2 em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% v/v de soro fetal bovino (FBS), 1.000 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e anfotericina B.
    2. Lave as células com 1 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS), colhida com 0,25% v/v de tripsina/EDTA.
    3. Colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
    4. Centrifugue as células à temperatura ambiente a 100 x g durante 5 min.
    5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e guardar o sedimento celular.
    6. Ressuspenda o pellet celular em meio de cultura DMEM com 10% v / v FBS e semeie em placas ópticas de fundo de 96 poços (0,05 x 106 células / poço).
      NOTA: As células são incubadas a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h antes de prosseguir com os tratamentos subsequentes.
  2. Indução de autofagia por inanição de soro
    1. Remova o meio de cultura de células e incube as células em meio DMEM privado de soro para remover o soro e induzir a autofagia por 6 h.
    2. Use bafilomicina A1 200 nM para inibir a lipofagia LD. O inibidor T863 (50 μM) da diacilglicerol aciltransferase-1 (DGAT1) inibe a biogênese da DL. Use o inibidor da carnitina palmitoiltransferase I (CPT1) Etomoxir (100 μM) para inibir a conversão de AGLs em acil-carnitina. Além disso, a lipólise pode ser inibida com o uso de ATGLstatina (10 μM).
  3. Fixação celular
    1. Lave as células três vezes com PBS-CM gelado (200 μL / poço).
    2. Fixar as células com paraformaldeído a 4% diluído em PBS suplementado com CaCl0,1 mM 2 e MgCl 1 mM2 (PBS-CM) em temperatura ambiente por 15 min16.
    3. Lave as células três vezes com PBS-CM (200 μL / poço).
    4. Permeabilize com 0,2% de Triton X-100 em PBS-CM em temperatura ambiente por 15 min.
    5. Lave as células três vezes com PBS-CM.
  4. Rotulagem de organelas
    1. Incubar as células com BODIPY 493/503 diluído a 0,5 μM e DAPI (125 mg/mL) em PBS-CM por 30 min a 37 °C.
    2. Lave três vezes com PBS-CM.
    3. Manter as células fixas e coradas em 200 μL de PBS por poço até a aquisição da imagem.
      NOTA: A placa de 96 poços pode ser armazenada a 4 °C por várias semanas, protegida da luz e da desidratação. A montagem com mídia de montagem antidesbotamento comumente usada não é necessária.
  5. Microscopia confocal automatizada (células fixas)
    1. Realize a coloração de núcleos para segmentação automatizada de imagens16.
      NOTA: A aquisição de imagens usa um microscópio de disco giratório com uma objetiva de imersão em água de 40x (NA 1.1). A aquisição de DAPI é realizada usando iluminação LED de 305 nm (Ex: 355-385 nm; Em: 430-500 nm), e a aquisição BODIPY 493/503 é realizada usando iluminação LED de 488 nm (Ex: 460-490 nm; Em: 550-550 nm).
  6. Análise de imagem
    NOTA: A análise de imagem16 é realizada usando software compatível com um módulo de análise LD dedicado. O software utilizado neste estudo (ver Tabela de Materiais) possui uma combinação de algoritmos de solução pronta (RMS Lipid Droplet Analysis) para segmentação e quantificação de imagens.
    1. Identifique os núcleos selecionando o canal DAPI e ajuste o limite com base no sinal e no plano de fundo.
    2. Identifique o citoplasma. Selecione o método apropriado com base no canal de fluorescência LDs.
    3. Identifique pontos ajustando os parâmetros: Raio (1-1,5 μm), Contraste (0,2-0,25), Intensidade não corrigida do ponto para a região (0,4-0,6), Distância (0,3-0,4 μm), Raio do pico do ponto (0,2-0,25 μm).
    4. Calcular propriedades de morfologia: selecione LDs populacionais, Ponto da região e método padrão e, em seguida, selecione Área.
    5. Calcular propriedades de intensidade: Selecione o canal LDs , os LDs da população, o ponto da região e o método padrão .
    6. Calcular propriedades: Selecione a População de todas as células, selecione o método por LDs de população relacionados e, em seguida, selecione o número de LDs, área e intensidade (média e soma; a soma é a densidade/intensidade de fluorescência integrada). Isso produzirá medições LD relacionadas à célula.
    7. Defina os resultados selecionando Saída padrão, Contagem de objetos, número de LDs por célula expresso como DP médio ±, LDs médios por área, LDs totais por área, Frações de LD por área e intensidade total de LDs.

Resultados

Imagem confocal de células vivas
Os LDs são dinâmicos e interagem transitoriamente com autofagossomos positivos para p62 / SQSTM1. Quando a lipofagia é induzida, essas interações diminuem o número de LDs e sua intensidade fluorescente total. Este protocolo usou versões fosfo-mutantes do receptor de autofagia p62 / SQSTM1 para examinar esses efeitos16.

O número e a intensidade de fluorescência dos LDs são r...

Discussão

Técnicas de imagem quantitativa, como microscopia confocal e protocolos de análise de imagem, forneceram informações valiosas sobre a dinâmica dos LDs durante a lipofagia 16,42,43. Essas tecnologias permitem a visualização e quantificação em tempo real dos LDs, permitindo a análise de seu número, tamanho e interações com outras organelas16. No entanto, uma da...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

O microscópio confocal robotizado Opereta foi financiado pelo Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072 bolsa. C.L. foi apoiado pela Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), bolsa de doutorado da Universidad San Sebastian. C.S. foi apoiado pela bolsa da Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. e J.C. foram apoiados pela bolsa N°1221374 do Fundo Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FONDECYT).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

Referências

  1. Yamamoto, H., Matsui, T. Molecular mechanisms of macroautophagy, microautophagy, and chaperone-mediated autophagy. J Nippon Med Sch. 91 (1), 2-9 (2024).
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