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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La lipofagia è una forma selettiva di autofagia che comporta la degradazione delle goccioline lipidiche. Le disfunzioni in questo processo sono associate allo sviluppo del cancro. Tuttavia, i meccanismi precisi non sono ancora del tutto compresi. Questo protocollo descrive approcci di imaging quantitativo per comprendere meglio l'interazione tra autofagia, metabolismo lipidico e progressione del cancro.

Abstract

La macroautofagia, comunemente indicata come autofagia, è un processo cellulare altamente conservato responsabile della degradazione dei componenti cellulari. Questo processo è particolarmente importante in condizioni come il digiuno, lo stress cellulare, il danno agli organelli, il danno cellulare o l'invecchiamento dei componenti cellulari. Durante l'autofagia, un segmento del citoplasma è racchiuso all'interno di vescicole a doppia membrana note come autofagosomi, che poi si fondono con i lisosomi. A seguito di questa fusione, il contenuto degli autofagosomi subisce una degradazione di massa non selettiva facilitata dai lisosomi. Tuttavia, l'autofagia mostra anche funzionalità selettive, prendendo di mira organelli specifici, tra cui mitocondri, perossisomi, lisosomi, nuclei e goccioline lipidiche (LD). Le goccioline lipidiche sono racchiuse da un monostrato fosfolipidico che isola i lipidi neutri dal citoplasma, proteggendo le cellule dagli effetti dannosi dell'eccesso di steroli e acidi grassi liberi (FFA). L'autofagia è implicata in varie condizioni, tra cui malattie neurodegenerative, disturbi metabolici e cancro. In particolare, la lipofagia – la degradazione autofagia-dipendente delle goccioline lipidiche – svolge un ruolo cruciale nella regolazione dei livelli intracellulari di FFA in diversi stati metabolici. Questa regolazione supporta processi essenziali come la sintesi di membrana, la formazione di molecole di segnalazione e il bilancio energetico. Di conseguenza, la lipofagia compromessa aumenta la vulnerabilità cellulare agli stimoli di morte e contribuisce allo sviluppo di malattie come il cancro. Nonostante la sua importanza, i meccanismi precisi che regolano il metabolismo delle goccioline lipidiche regolate dalla lipofagia nelle cellule tumorali rimangono poco compresi. Questo articolo si propone di descrivere l'acquisizione di immagini confocali e i protocolli di analisi quantitativa dell'imaging che consentono lo studio della lipofagia associata a cambiamenti metabolici nelle cellule tumorali. I risultati ottenuti attraverso questi protocolli possono far luce sull'intricata interazione tra autofagia, metabolismo lipidico e progressione del cancro. Chiarendo questi meccanismi, potrebbero emergere nuovi bersagli terapeutici per combattere il cancro e altre malattie metaboliche.

Introduzione

Autofagia è un termine generico usato per descrivere i processi catabolici in cui la cellula trasporta i suoi componenti al lisosoma per la degradazione. Ad oggi, sono stati identificati tre tipi di autofagia: microautofagia, macroautofagia e autofagia mediata da chaperone 1,2,3. La macroautofagia, di seguito denominata autofagia, è una via essenziale per regolare l'omeostasi cellulare. La rottura di questo equilibrio può portare allo sviluppo di condizioni patologiche4.

L'autofagia è un processo complesso che prevede più passaggi. Il primo passo è l'induzione dell'autofagia, innescata da vari stimoli come la sospensione dei fattori di crescita (insulina e fattori di crescita insulino-simili), infezioni patogene, riduzione dei livelli di energia cellulare (ATP), stress extracellulare o intracellulare (ad esempio, ipossia, stress del reticolo endoplasmatico (ER), stress ossidativo) e carenza di nutrienti (aminoacidi, glucosio)5. La seconda fase prevede la formazione del fagoforo, in cui viene avviato l'isolamento della membrana dal reticolo endoplasmatico, dalla membrana plasmatica e dai mitocondri. La formazione de novo coinvolge un meccanismo conservato di proteine citosoliche che vengono reclutate in sequenza6, come il complesso chinasi-1 Ser/Thr chinasi Unc-51-like (ULK1: ATG1 nel lievito), Beclin-1 e VPS347. Dopo la formazione del complesso ULK1, il complesso I di classe III fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) viene reclutato nella membrana isolata (IM), che funziona nel sequestro iniziale dei carichi8. Inoltre, il complesso ULK1 ha la capacità di reclutare ATG9 nella membrana di isolamento (IM), un passaggio essenziale poiché le vescicole ATG9 sono riconosciute come trasportatori di membrana che facilitano l'espansione IM9.

Due sistemi di coniugazione ubiquitina-simili (Ubl) sono fondamentali per il processo di espansione: il sistema della catena leggera 3 della proteina 1 associata ai microtubuli (LC3-I) e il sistema ATG1210. Prima della coniugazione, il precursore LC3 subisce la scissione. La LC3-I citosolica viene quindi coniugata alla fosfatidiletanolammina (PE) per produrre la LC3-PE associata alla membrana (LC3-II), che facilita la formazione dell'autofagosoma11. Durante questo processo, il carico deve essere internalizzato nell'autofagosoma a doppia membrana in formazione. L'autofagia può internalizzare bersagli casuali per la degradazione o catturare carichi selettivi attraverso specifici recettori dell'autofagia come p62/SQSTM112. L'ultimo passo è la fusione dell'autofagosoma formato con i lisosomi, che porta alla formazione dell'autolisosoma. Sebbene il meccanismo preciso per la formazione dell'autolisosoma rimanga sfuggente, i complessi leganti la membrana, la proteina legante il GTP correlata al RAS e le proteine dei recettori della proteina di attaccamento del fattore sensibile alla N-etilmaleimmide solubile (SNARE) sono coinvolti in questo processo di fusione13. Inoltre, il sistema del citoscheletro dei microtubuli è essenziale per il traffico di autofagosomi maturi e lisosomi da siti di iniziazione casuali verso l'area perinucleare per la formazione di autolisosomi 14,15,16. Nell'autolisosoma, i carichi sequestrati in modo casuale o selettivo vengono degradati proteoliticamente dalle proteasi lisosomiali17.

Il processo di autofagia è conservato in tutti gli organismi eucarioti ed è cruciale nella regolazione delle condizioni intracellulari attraverso il turnover citoplasmatico. Rimuove le proteine mal ripiegate o aggregate, elimina i patogeni intracellulari e rimuove gli organelli danneggiati. Diversi organelli, tra cui il reticolo endoplasmatico, i mitocondri, i perossisomi, i lisosomi, il nucleo e i LD, sono stati segnalati come bersagli dell'autofagia 16,18,19,20,21,22. Le LD originano dall'ER e sono organi di stoccaggio essenziali centrali per l'omeostasi lipidica ed energetica. La loro architettura distinta è costituita da un nucleo idrofobico di lipidi neutri racchiuso da un monostrato fosfolipidico incorporato con proteine specifiche. Queste goccioline possono interagire con vari organelli cellulari attraverso i siti di contatto della membrana23. Inoltre, l'autofagia aiuta a riciclare le risorse primarie per mantenere condizioni cellulari ottimali. Ad esempio, la degradazione delle LD può portare alla produzione di ATP attraverso l'ossidazione β degli acidi grassi24.

L'autofagia è associata a varie malattie, tra cui malattie neurodegenerative, disturbi metabolici e cancro17. L'autofagia può promuovere o inibire la crescita tumorale nel cancro, a seconda del contesto25,26. Ad esempio, i topi Beclin 1 +/- mostrano un'alta incidenza di linfomi e carcinomi spontanei in organi come il polmone, il fegato e il tessuto mammario. Al contrario, la perdita del gene Atg7 correlato all'autofagia nelle cellule epiteliali intestinali attenua la crescita tumorale guidata dalla perdita del soppressore tumorale primario nel cancro del colon-retto, la poliposi adenomatosa coli (APC)27,28. Pertanto, la perdita di geni correlati all'autofagia può avere effetti opposti sulla crescita del tumore.

Le cellule tumorali devono produrre energia per sostenere la loro crescita, divisione e sopravvivenza29. Hanno un'elevata avidità per i lipidi, che vengono utilizzati per la biosintesi di componenti strutturali e la produzione di energia30. Le cellule tumorali possono adattare il loro metabolismo alle condizioni ambientali. Ad esempio, quando la glicolisi è soppressa nelle cellule HeLa derivate dal cancro cervicale, la fosforilazione ossidativa viene aumentata per ottenere l'ATP necessario per la sopravvivenza31. I lipidi in una cellula non esistono come FFA non esterificati a causa della loro potenziale citotossicità ad alte concentrazioni. Invece, le cellule immagazzinano FFA e colesterolo come biomolecole neutre e inerti come esteri sterolici e trigliceridi nelle LD32. Di conseguenza, la lipofagia può contribuire al metabolismo del cancro fornendo FFA per produrre energia, un campo emergente nella ricerca sul cancro. Tuttavia, i percorsi che sovraregolano l'ossidazione mitocondriale dell'FA nelle cellule tumorali rimangono poco compresi. È stato dimostrato che l'assorbimento e l'accumulo di FFA aumentano l'aggressività di diversi tipi di cancro 33,34,35. La riprogrammazione del metabolismo lipidico è un segno distintivo della riprogrammazione metabolica del cancro, svolgendo un ruolo fondamentale come risposta adattativa per gestire scenari fisiologici avversi nel microambiente tumorale36,37. Infatti, l'accumulo di LD è stato osservato in molti tumori umani, inclusi i tumori del polmone, della mammella e della prostata, ed è associato ad aggressività e prognosi clinica infausta 38,39,40.

Data l'importanza dell'autofagia e delle LD nel metabolismo del cancro e i meccanismi poco compresi, è essenziale stabilire protocolli per studiare il loro contributo allo sviluppo del cancro. Questo studio descrive un protocollo per valutare la lipofagia attraverso l'acquisizione di immagini confocali e protocolli di analisi di imaging quantitativo per studiare i cambiamenti metabolici dei lipidi nelle cellule tumorali.

Protocollo

Questo studio è stato condotto utilizzando cellule HeLa dell'adenocarcinoma epiteliale (CCL2, ATCC). Il protocollo si concentra sullo studio delle goccioline lipidiche (LD) durante l'induzione della lipofagia in cellule vive per quantificare l'andamento temporale della variazione del numero LD e le interazioni LD-autofagosoma nelle cellule che esprimono il wild-type (p62/SQSTM1-S182S) e due mutanti sito-specifici del recettore dell'autofagia p62/SQSTM116. L'espressione di una forma fosfo-difettosa (p62/SQSTM1-S182A) aumenta il numero di LD, mentre l'espressione di una forma fosfo-mima (p62/SQSTM1-S182E) riduce il numero di LD16. In primo luogo, viene descritto un metodo per analizzare le LD in cellule vive utilizzando la microscopia confocale. Quindi, il protocollo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini imparziali e completamente automatizzate viene spiegato utilizzando un microscopio confocale robotizzato. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Imaging confocale di cellule vive

  1. Coltura cellulare
    1. Coltivare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 nel Medium di Eagle Modificato di Dulbecco (DMEM), integrato con il 10% v/v di siero fetale bovino (FBS), 1.000 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e amfotericina B. Mantenere le cellule fino a quando non raggiungono più dell'80% di confluenza.
    2. Lavare le celle con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x, raccogliere utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25% v/v e centrifugare a 100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.
    4. Risospendere le cellule nel terreno di coltura DMEM con FBS al 10% v/v e seminare (0,05 x 106 cellule/pozzetto) in piastre con fondo di vetro da 35 mm.
    5. Trasfettare le cellule utilizzando la trasfezione TransIT-LT1 o il reagente Lipofectamine 2000. Utilizzare 1 μg di DNA plasmidico di ciascuna fosfo-variante p62/SQSTM1-mcherry e p62/SQSTM1-mcherry16 wild-type.
    6. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore prima di procedere con i trattamenti successivi.
      NOTA: A 16-24 ore dopo la trasfezione, p62/SQSTM1 forma grandi condensati piuttosto che autofagosomi discreti di p62/SQSTM1. Questi grandi condensati si dissipano in gran parte entro le 48 ore, consentendo un'osservazione più precisa degli autofagosomi.
  2. Etichettatura di organelli
    1. Lavare due volte le celle in una pirofila con fondo di vetro con 1x PBS (preriscaldato a 37 °C).
    2. Incubare le cellule con BODIPY 493/503 diluito a 0,5 μM in terreno DMEM integrato con 10 mM HEPES e conservare per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2. Anche BODIPY 405 e BODIYPY 633 possono essere utilizzati con gli stessi risultati.
    3. Verificare che l'espressione delle varianti p62/SQSTM1 induca cambiamenti nel numero di LD e nell'intensità totale della fluorescenza.
    4. Lavare le cellule con 1x PBS (temperatura ambiente) e mantenerle in DMEM privo di fenolo rosso integrato con 10 mM di tampone HEPES qualificato ES per l'imaging di cellule vive.
      NOTA: BODIPY 493/503 emette fluorescenza verde brillante, il che lo rende comodo per l'etichettatura a doppia fluorescenza. Tuttavia, in determinate condizioni, come l'eccitazione ripetuta, può emettere fluorescenza rossa, portando potenzialmente a interpretazioni errate (falsa colocalizzazione) se combinato con marcatori rossi. Per ulteriori informazioni sui fluorofori di eccitazione a 550 nm, fare riferimento all'articolo di Ohsaki et al.41.
  3. Acquisizione di immagini al microscopio confocale nell'imaging di cellule vive
    NOTA: Le immagini dei LD vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo a immersione in olio 63x (N.A. 1.4). Per l'acquisizione delle immagini è stato utilizzato un software di acquisizione immagini compatibile. La temperatura viene mantenuta a 37 °C utilizzando un sistema di controllo automatico della temperatura.
    NOTA: Le immagini delle goccioline lipidiche (LD) sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo a immersione in olio 63x (N.A. 1.4). Per catturare le immagini è stato utilizzato un software di acquisizione immagini compatibile. La temperatura è stata mantenuta a 37 °C utilizzando un sistema di controllo automatico della temperatura.
    1. Regolare il laser ad argon multilinea al 10% di potenza di lavoro, con la linea laser a 488 nm all'1%-2% di potenza di lavoro, con una potenza laser complessiva dello 0,1%-0,2%.
    2. Per ridurre al minimo i danni alle celle e il fotosbiancamento della sonda, regolare il laser a 568 nm al 3%-5% di potenza.
    3. Regolare le impostazioni di acquisizione delle immagini nel software su una risoluzione di 1024 x 1024 pixel. Il sistema utilizza un rivelatore ibrido operante a 600 Hz, con una media di 2.
    4. Regolare gli intervalli spettrali tra 478-494 nm (emissione verde per LD) e 600-625 nm di lunghezza d'onda (emissione rossa per mCherry).
    5. Regolare la dimensione del foro stenopeico su 1 unità Airy (AU) per una lunghezza d'onda di 488 nm.
    6. Incubare le cellule con 8-Br-cAMP (100 mM) per attivare la PKA chinasi e aumentare la degradazione delle LD16.
    7. Cattura immagini fluorescenti a intervalli di 5 minuti, 37 °C per 60 minuti.
  4. Analisi delle immagini
    1. Aprite un file stack contenente singole sequenze di immagini dal vivo utilizzando ImageJ. Utilizza il ROI manager per la segmentazione manuale delle cellule. Salva le regioni per il passaggio successivo.
    2. Apri il file stack e richiama le regioni salvate per ogni immagine. Regolare la soglia del canale LD.
    3. Misura l'intensità totale della fluorescenza selezionando multi-misura sul gestore del ROI.
      NOTA: Durante l'autofagia, l'intensità totale della fluorescenza e il numero di LD possono cambiare in modo significativo. Inoltre, le interazioni tra LD e lisosomi aumentano durante l'induzione dell'autofagia.
  5. Analisi dei contatti e della colocalizzazione
    1. Eseguire un'acquisizione multispettrale a intervalli di 1 s per 5 minuti a 37 °C.
    2. Impostare il laser multilinea ad argon gassoso al 10% di potenza, con la linea laser a 488 nm allo 0,1%-0,5% di potenza di lavoro per ridurre al minimo i danni alle celle e il fotosbiancamento della sonda. Regola il laser a 568 nm al 3%-5% di potenza.
    3. Fare clic su ComDet V: Plugin < ComDet V 0.5.3 < rilevare le particelle. Definisce la distanza minima che i punti devono avere per essere considerati colocalizzati.
    4. Scegli i parametri che definiscono la particella, come la sua dimensione (mm o unità di pixel) e la soglia, per entrambi i canali in modo indipendente. Verrà fornito un riepilogo con il numero di particelle in ciascun canale per ogni volta e la corrispondente percentuale di colocalizzazione, che può essere esportato in Excel (vedi File supplementare 1).
      NOTA: Il plug-in ComDet V è consigliato per organelli di forma ovale, come goccioline lipidiche, endosomi, perossisomi o lisosomi. Non è raccomandato per la colocalizzazione con organelli come i mitocondri. Il plugin "ComDet V" (distribuzione ImageJ FIJI) consente di analizzare la colocalizzazione temporale attraverso l'analisi delle particelle. Per installarlo nelle Fiji, copia l'URL http://sites.imagej.net/Ekatrukha/, vai su Guida, Aggiorna, seleziona Gestisci siti di aggiornamento - Aggiungi sito di aggiornamento e incolla l'URL. Applicare le modifiche; Si consiglia di utilizzare due canali. Se sono presenti più canali, separali e unisciti nuovamente utilizzando Unisci.
  6. Movimento dinamico dei LD
    1. Definisci le regioni di interesse (ROI) per le perline e le celle e salvale. Vai su plugin e seleziona Tracking e TrackMate.
    2. Aprire TrackMate. La prima finestra del plug-in fornisce informazioni sugli intervalli di tempo in cui vengono acquisite le immagini e sulla risoluzione dell'immagine. Per confermare gli intervalli di tempo senza apportare modifiche, fare clic su AVANTI.
    3. Selezionare Rilevatore LoG e quindi AVANTI. Nella configurazione del rivelatore LoG, filtrare le particelle in base al loro diametro, da 0,8 a 1,0 micron, e impostare una soglia appropriata. Eseguire un'anteprima per confermare i parametri corretti e fare clic su AVANTI.
    4. Imposta la Soglia iniziale, una soglia di qualità che limita il numero di punti da analizzare. Questo è necessario quando si seguono molti punti dell'aereo, il che è impegnativo. Non utilizzare il filtro; premere NEXT senza modificare i parametri.
    5. Seleziona una visualizzazione: scegli HyperStack Displayer e fai clic su AVANTI.
    6. Selezionare Tracciatore LAP a movimento lineare per particelle con velocità costante nel piano.
    7. Definisce la distanza massima tra due punti all'inizio di una nuova traccia. A seconda delle immagini, si suggerisce che sia compreso tra 0,5 e 1 micron.
    8. Impostare la distanza massima da una posizione prevista per i punti candidati per l'analisi.
    9. Imposta Max Frame Gap come tempo massimo per seguire un punto che potrebbe scomparire dal piano focale. Si consigliano due punti orari.
    10. Selezionare Opzioni di visualizzazione. La tabella riassuntiva, che include la velocità minima, la velocità massima, la velocità media, la velocità mediana e lo spostamento del binario, viene esportata in Excel (vedere il file supplementare 2).
    11. Selezionare Funzioni di stampa. Per rappresentare visivamente i risultati, vai su Tracce. Seleziona la misura da rappresentare (velocità e spostamento) sull'asse X e i punti vengono posizionati sull'asse Y.
    12. Seleziona un'azione per salvare i video che mostrano il movimento dei punti. Ciò consente la visualizzazione di punti che mostrano cambiamenti significativi.
      NOTA: Il miglioramento dell'autofagia ottimizza il flusso cellulare e riduce il numero di LD, evidenziando il suo ruolo cruciale nella regolazione metabolica e nell'omeostasi cellulare16. I plug-in menzionati sono disponibili per il software ImageJ (distribuzione FIJI). È possibile utilizzare anche software equivalenti. Per tutte le misurazioni dell'intensità della fluorescenza, è stata utilizzata la densità di fluorescenza integrata ("RawIntDen" in ImageJ), che rappresenta la fluorescenza totale in ciascun pixel dell'immagine, prendendo in considerazione l'area.

2. Acquisizione e analisi di immagini confocali completamente automatizzate in celle fisse

NOTA: Questo metodo consente di valutare diverse condizioni e di sviluppare misurazioni in triplice copia per ciascuna condizione, migliorando l'affidabilità nei valori medi misurati e consentendo la determinazione della deviazione standard o dell'errore standard per la differenziazione statistica tra gli esperimenti. Il flusso di lavoro del metodo è illustrato nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1.

  1. Coltura cellulare
    1. Coltura delle cellule a 37 °C e 5% di CO2 nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) v/v, 1.000 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e amfotericina B.
    2. Lavare le cellule con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x, raccolta utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25% v/v.
    3. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml.
    4. Centrifugare le celle a temperatura ambiente a 100 x g per 5 min.
    5. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta e conservare il pellet cellulare.
    6. Risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura DMEM con FBS al 10% v/v e seminare in piastre ottiche a 96 pozzetti (0,05 x 106 cellule/pozzetto).
      NOTA: Le cellule vengono incubate a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore prima di procedere con i trattamenti successivi.
  2. Induzione dell'autofagia per fame di siero
    1. Rimuovere il terreno di coltura cellulare e incubare le cellule in terreno DMEM privato del siero per rimuovere il siero e indurre l'autofagia per 6 ore.
    2. Utilizzare la bafilomicina A1 200 nM per inibire la lipofagia LD. L'inibitore T863 (50 μM) della diacilglicerolo aciltransferasi-1 (DGAT1) inibisce la biogenesi delle LD. Utilizzare l'inibitore della carnitina palmitoiltransferasi I (CPT1) Etomoxir (100 μM) per inibire la conversione degli FFA in acil-carnitina. Inoltre, la lipolisi può essere inibita utilizzando l'ATGLstatina (10 μM).
  3. Fissazione cellulare
    1. Lavare le cellule tre volte con PBS-CM ghiacciato (200 μL/pozzetto).
    2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% diluita in PBS integrato con 0,1 mM di CaCl2 e 1 mM di MgCl2 (PBS-CM) a temperatura ambiente per 15 min16.
    3. Lavare le celle tre volte con PBS-CM (200 μL/pozzetto).
    4. Permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,2% in PBS-CM a temperatura ambiente per 15 min.
    5. Lavare le celle tre volte con PBS-CM.
  4. Etichettatura di organelli
    1. Incubare le cellule con BODIPY 493/503 diluito a 0,5 μM e DAPI (125 mg/mL) in PBS-CM per 30 minuti a 37 °C.
    2. Lavare tre volte con PBS-CM.
    3. Conservare le cellule fissate e colorate in 200 μL di PBS per pozzetto fino all'acquisizione dell'immagine.
      NOTA: La piastra a 96 pozzetti può essere conservata a 4 °C per diverse settimane, al riparo dalla luce e dalla disidratazione. Non è necessario il montaggio con supporti di montaggio antifading di uso comune.
  5. Microscopia confocale automatizzata (cellule fisse)
    1. Eseguire la colorazione dei nuclei per la segmentazione automatizzata delle immagini16.
      NOTA: L'acquisizione delle immagini utilizza un microscopio a disco rotante con un obiettivo a immersione in acqua 40x (N.A 1.1). L'acquisizione DAPI viene eseguita utilizzando un'illuminazione a LED a 305 nm (Es: 355-385 nm; Em: 430-500 nm) e l'acquisizione BODIPY 493/503 viene eseguita utilizzando un'illuminazione LED a 488 nm (Es: 460-490 nm; Em: 550-550 nm).
  6. Analisi delle immagini
    NOTA: L'analisi delle immagini16 viene eseguita utilizzando un software compatibile con un modulo di analisi LD dedicato. Il software utilizzato in questo studio (vedi Tabella dei materiali) ha una combinazione di algoritmi già pronta (RMS Lipid Droplet Analysis) per la segmentazione e la quantificazione delle immagini.
    1. Identificare i nuclei selezionando il canale DAPI e regolare la soglia in base al segnale e allo sfondo.
    2. Identificare il citoplasma. Selezionare il metodo appropriato in base al canale di fluorescenza LD.
    3. Identifica i punti regolando i parametri: raggio (1-1,5 μm), contrasto (0,2-0,25), intensità da punto a regione non corretta (0,4-0,6), distanza (0,3-0,4 μm), raggio di picco del punto (0,2-0,25 μm).
    4. Calcolare le proprietà morfologiche: selezionare LD della popolazione, Region Spot e metodo standard , quindi selezionare Area.
    5. Calcola le proprietà di intensità: seleziona il canale LD, i LD della popolazione, lo spot della regione e il metodo standard .
    6. Calcola proprietà: selezionare la popolazione di tutte le celle, selezionare il metodo in base ai LD della popolazione correlati, quindi selezionare il numero di LD, l'area e l'intensità (media e somma; la somma è la densità/intensità di fluorescenza integrata). Ciò produrrà misurazioni LD relative alla cella.
    7. Definisci i risultati selezionando Output standard, Conteggio oggetti, Numero di LD per cella espresso come media ± SD, LD medi per area, LD totali per area, Frazioni di LD per area e Intensità LD totali.

Risultati

Imaging confocale di cellule vive
Le LD sono dinamiche e interagiscono transitoriamente con gli autofagosomi p62/SQSTM1-positivi. Quando viene indotta la lipofagia, queste interazioni diminuiscono il numero di LD e la loro intensità fluorescente totale. Questo protocollo ha utilizzato versioni fosfo-mutanti del recettore dell'autofagia p62/SQSTM1 per esaminare questi effetti16.

Il numero e l'intensità di fluorescen...

Discussione

Le tecniche di imaging quantitativo, come la microscopia confocale e i protocolli di analisi delle immagini, hanno fornito preziose informazioni sulla dinamica delle LD durante la lipofagia 16,42,43. Queste tecnologie consentono la visualizzazione e la quantificazione in tempo reale dei LD, consentendo l'analisi del loro numero, dimensione e interazioni con altri organelli16

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Riconoscimenti

Il microscopio confocale robotizzato Operetta è stato finanziato dal Fondo de Equipamiento Mediano (FONDEQUIP) N° EQM220072 grant. C.L. è stato sostenuto dalla Vicerrectoria de Investigación y Doctorados (VRID), borsa di studio per il dottorato dell'Universidad San Sebastian. C.S. è stato sostenuto dalla borsa di studio dell'Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID). D.T. e J.C. sono stati sostenuti dalla sovvenzione del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT) N°1221374.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C
Bafilomycin A1Tocris1334200 nM
BODIPY 493/503InvitrogenD39220.5 mM
CaCl2Merck1023780.1 mM
ComDet V PluginImageJImageJ FIJI
DAPIInvitrogenD1306125 mg/mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Gibco12800017
ES-qualified HEPES bufferCytiva HyClone AdvanceSTEMSH308510110 mM
EtomoxirSigmaAldrichE1905100 mM
Fetal Bovine SerumCytiva HyClone AdvanceSTEMSH303960310% v/v
Forma Series II Water-Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific311137 °C, 5% CO2
Harmony Phenologic softwareRevvityimage analysis software
HeLa cellsATCCCCL-2Maintain cells at a low passage number, ideally between 8 and 10, to ensure optimal cellular characteristics.
HEPESMerck11011010 mM
High-speed clinical centrifugeDLABDM0412
Immersion OilLeica11513859
MgCl2Merck8147331 mM
Operetta CLS Live spinning-disk microscopeRevvityHH16000020
Optical bottom 96-well platesThermo Scientific165305
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences157-84%v/v
penicillin/streptomycin/Amphotericin BBiological Industries030331b(1000 µ/mL, 100 mg/mL, 100 mg/mL)
Phosphate-buffered saline (PBS)Sartorius020235A1x
Red-phenol free DMEMGibco31053028
T863MerckSML053950 mM
TCS SP8 Leica confocal microscopeLeica Microsystems
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2304
Triton X-100MerckT92840.20%
Trypsin/EDTAGibco2520000560.25% v/v
UNO-TEMP controllerOkolabOK-H401-T-CONTROLLER37 °C

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