التحليل التمهيدي والتحقق من صحة بيانات تسلسل CUT &RUN

Summary

يوجه هذا البروتوكول المبتدئين في المعلوماتية الحيوية من خلال خط أنابيب تحليل CUT &RUN التمهيدي الذي يمكن المستخدمين من إكمال التحليل الأولي والتحقق من صحة بيانات تسلسل CUT&RUN. سيسمح إكمال خطوات التحليل الموضحة هنا ، جنبا إلى جنب مع التعليق التوضيحي للذروة النهائية ، للمستخدمين باستخلاص رؤى ميكانيكية لتنظيم الكروماتين.

Abstract

تسهل تقنية CUT & RUN الكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي عبر الجينوم. تشمل التطبيقات النموذجية ل CUT & RUN تغييرات التنميط في تعديلات ذيل الهيستون أو رسم خرائط شغل كروماتين عامل النسخ. إن الاعتماد الواسع النطاق ل CUT & RUN مدفوع جزئيا بالمزايا التقنية مقارنة ب ChIP-seq التقليدية التي تشمل متطلبات إدخال الخلايا المنخفضة ، ومتطلبات عمق التسلسل المنخفضة ، وزيادة الحساسية مع إشارة الخلفية المنخفضة بسبب نقص عوامل الربط المتقاطع التي تخفي حواتم الأجسام المضادة. كما تم تحقيق اعتماد CUT & RUN على نطاق واسع من خلال المشاركة السخية للكواشف من قبل مختبر Henikoff وتطوير مجموعات تجارية لتسريع اعتماد المبتدئين. مع زيادة الاعتماد الفني ل CUT &RUN ، يصبح تحليل تسلسل CUT &RUN والتحقق من صحته اختناقات حاسمة يجب التغلب عليها لتمكين التبني الكامل من قبل فرق المختبر الرطبة في الغالب. يبدأ تحليل CUT &RUN عادة بفحوصات مراقبة الجودة على قراءات التسلسل الخام لتقييم عمق التسلسل وجودة القراءة والتحيزات المحتملة. ثم تتم محاذاة القراءات مع مجموعة تسلسل الجينوم المرجعي ، ويتم استخدام العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية لاحقا للتعليق على المناطق الجينومية لإثراء البروتين ، وتأكيد قابلية تفسير البيانات ، واستخلاص استنتاجات بيولوجية. على الرغم من تطوير العديد من خطوط أنابيب تحليل السيليكو لدعم تحليل بيانات CUT & RUN ، إلا أن هيكلها المعقد متعدد الوحدات واستخدام لغات برمجة متعددة يجعل الأنظمة الأساسية صعبة على مبتدئي المعلوماتية الحيوية الذين قد يفتقرون إلى الإلمام بلغات برمجة متعددة ولكنهم يرغبون في فهم إجراء تحليل CUT & RUN وتخصيص خطوط أنابيب التحليل الخاصة بهم. هنا ، نقدم بروتوكول خط أنابيب تحليل CUT &RUN خطوة بخطوة بلغة واحدة مصمم للمستخدمين الذين لديهم أي مستوى من الخبرة في المعلوماتية الحيوية. يتضمن هذا البروتوكول إكمال فحوصات الجودة الهامة للتحقق من أن بيانات التسلسل مناسبة للتفسير البيولوجي. نتوقع أن يسمح اتباع البروتوكول التمهيدي المقدم في هذه المقالة جنبا إلى جنب مع التعليق التوضيحي لذروة المصب للمستخدمين باستخلاص رؤى بيولوجية من مجموعات بيانات CUT &RUN الخاصة بهم.

Introduction

تعد القدرة على قياس التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي الجيني أمرا أساسيا لفهم بيولوجيا تنظيم الكروماتين. توفر المقايسات الفعالة التي تقيس احتلال الكروماتين لبروتين معين قطعتين رئيسيتين على الأقل من المعلومات: أنا) التوطين الجيني و ب) وفرة البروتين في منطقة جينومية معينة. يمكن أن يكشف تتبع تغييرات التوظيف والتوطين لبروتين ذي أهمية في الكروماتين عن المواقع المستهدفة المباشرة للبروتين ويكشف عن الأدوار الميكانيكية لهذا البروتين في العمليات البيولوجية القائمة على الكروماتين مثل تنظيم النسخ أو إصلاح الحمض النووي أو تكرار الحمض النووي. تمكن التقنيات المتاحة اليوم لتمييز تفاعلات البروتين والحمض النووي الباحثين من استكشاف التنظيم بدقة غير....

Protocol

ملاحظة: تتوفر معلومات عن ملفات CUT&RUN fastq في GSE126612 في الجدول 1. وترد المعلومات المتعلقة بتطبيقات البرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تنزيل خط أنابيب Easy-Shells_CUTnRUN من صفحة Github الخاصة به

1. افتح المحطة من نظام التشغيل.
   ملاحظة: إذا لم يكن المستخدم متأكدا من كيفية فتح الجهاز الطرفي في macOS و Windows ، فراجع صفحة الويب هذه (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). بالنسبة لنظام التشغيل Linux ، راجع صفحة الويب هذه (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/).
2. قم بتنز....

النتائج

تحتفظ الجودة والتشذيب بالمحول بالقراءات بجودة تسلسل عالية
تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية عرضة لتوليد أخطاء في التسلسل مثل "طفرات" التسلسل في القراءات. علاوة على ذلك ، يمكن إثراء ثنائيات محول التسلسل في مجموعات بيانات التسلسل بسبب سوء إزالة المحول أثناء إعدا?.......

Discussion

تعد القدرة على رسم خريطة لشغل البروتين على الكروماتين أمرا أساسيا لإجراء دراسات ميكانيكية في مجال بيولوجيا الكروماتين. نظرا لأن المختبرات تتبنى تقنيات مختبرية رطبة جديدة لتوصيف الكروماتين ، فإن القدرة على تحليل بيانات التسلسل من تلك التجارب المعملية الرطبة تصبح عنق ا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming