Einführende Analyse und Validierung von CUT&RUN-Sequenzierungsdaten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll führt Bioinformatik-Einsteiger durch eine einführende CUT&RUN-Analysepipeline, die es den Benutzern ermöglicht, eine erste Analyse und Validierung von CUT&RUN-Sequenzierungsdaten durchzuführen. Das Abschließen der hier beschriebenen Analyseschritte in Kombination mit der nachgeschalteten Peak-Annotation ermöglicht es den Benutzern, mechanistische Einblicke in die Chromatinregulation zu gewinnen.

Zusammenfassung

Die CUT&RUN-Technik erleichtert den Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen im gesamten Genom. Typische Anwendungen von CUT&RUN sind die Profilierung von Änderungen in Histonschwanzmodifikationen oder die Kartierung der Chromatinbelegung des Transkriptionsfaktors. Die weit verbreitete Einführung von CUT&RUN ist zum Teil auf technische Vorteile gegenüber herkömmlichem ChIP-seq zurückzuführen, zu denen geringere Anforderungen an den Zelleinsatz, geringere Anforderungen an die Sequenzierungstiefe und eine erhöhte Empfindlichkeit mit reduziertem Hintergrundsignal gehören, da es an Vernetzungsmitteln mangelt, die sonst Antikörper-Epitope maskieren. Die breite Akzeptanz von CUT&RUN wurde auch durch die großzügige gemeinsame Nutzung von Reagenzien durch das Henikoff-Labor und die Entwicklung kommerzieller Kits erreicht, um die Einführung für Anfänger zu beschleunigen. Mit zunehmender technischer Einführung von CUT&RUN werden die CUT&RUN-Sequenzierungsanalyse und -validierung zu kritischen Engpässen, die überwunden werden müssen, um eine vollständige Einführung durch überwiegend nasse Laborteams zu ermöglichen. Die CUT&RUN-Analyse beginnt in der Regel mit einer Qualitätskontrolle der Rohsequenzierungs-Reads, um die Sequenzierungstiefe, die Read-Qualität und mögliche Verzerrungen zu bewerten. Die Reads werden dann mit einer Referenzgenomsequenz-Assemblierung abgeglichen, und mehrere bioinformatische Werkzeuge werden anschließend eingesetzt, um genomische Regionen der Proteinanreicherung zu annotieren, die Interpretierbarkeit der Daten zu bestätigen und biologische Schlussfolgerungen zu ziehen. Obwohl mehrere In-silico-Analysepipelines entwickelt wurden, um die CUT&RUN-Datenanalyse zu unterstützen, machen ihre komplexe Multi-Modul-Struktur und die Verwendung mehrerer Programmiersprachen die Plattformen für Bioinformatik-Anfänger schwierig, die möglicherweise nicht mit mehreren Programmiersprachen vertraut sind, aber das CUT&RUN-Analyseverfahren verstehen und ihre Analysepipelines anpassen möchten. Hier stellen wir ein einsprachiges Schritt-für-Schritt-Analyse-Pipeline-Protokoll für CUT&RUN zur Verfügung, das für Benutzer mit jeder Erfahrung in der Bioinformatik entwickelt wurde. Dieses Protokoll umfasst die Durchführung kritischer Qualitätsprüfungen, um zu bestätigen, dass die Sequenzierungsdaten für die biologische Interpretation geeignet sind. Wir gehen davon aus, dass das Befolgen des in diesem Artikel vorgestellten Einführungsprotokolls in Kombination mit der Downstream-Peak-Annotation es den Nutzern ermöglicht, biologische Erkenntnisse aus ihren eigenen CUT&RUN-Datensätzen zu gewinnen.

Einleitung

Die Fähigkeit, Wechselwirkungen zwischen Proteinen und genomischer DNA zu messen, ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Biologie der Chromatinregulation. Effektive Assays, die die Chromatinbelegung für ein bestimmtes Protein messen, liefern mindestens zwei Schlüsselinformationen: i) die genomische Lokalisierung und ii) die Proteinhäufigkeit in einer bestimmten genomischen Region. Die Verfolgung der Rekrutierungs- und Lokalisierungsänderungen eines Proteins von Interesse im Chromatin kann direkte Zielloci des Proteins aufdecken und mechanistische Rollen dieses Proteins in chromatinbasierten biologischen Prozessen wie ....

Protokoll

HINWEIS: Informationen zu CUT&RUN fastq-Dateien in GSE126612 finden Sie in Tabelle 1. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Softwareanwendungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herunterladen der Easy-Shells_CUTnRUN-Pipeline von der Github-Seite

1. Öffnen Sie das Terminal über das Betriebssystem.
   HINWEIS: Wenn der Benutzer nicht sicher ist, wie das Terminal unter macOS und Windows geöffnet werden soll, lesen Sie diese Webseite (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Für Linux lesen Sie bitte diese We....

Diskussion

Die Fähigkeit, die Proteinbelegung auf dem Chromatin zu kartieren, ist von grundlegender Bedeutung für die Durchführung mechanistischer Studien auf dem Gebiet der Chromatinbiologie. Da Labore neue Nasslabortechniken zur Profilierung des Chromatins einführen, wird die Fähigkeit, Sequenzierungsdaten aus diesen Nasslaborexperimenten zu analysieren, zu einem häufigen Engpass für Nasslaborwissenschaftler. Daher beschreiben wir ein einführendes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das es Bi.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming