Análisis introductorio y validación de datos de secuenciación CUT&RUN

Resumen

Este protocolo guía a los principiantes en bioinformática a través de una línea de análisis introductoria de CUT&RUN que permite a los usuarios completar un análisis inicial y la validación de los datos de secuenciación de CUT&RUN. Completar los pasos de análisis descritos aquí, combinados con la anotación de picos aguas abajo, permitirá a los usuarios extraer información mecanicista sobre la regulación de la cromatina.

Resumen

La técnica CUT&RUN facilita la detección de las interacciones proteína-ADN en todo el genoma. Las aplicaciones típicas de CUT&RUN incluyen la creación de perfiles de cambios en las modificaciones de la cola de histonas o el mapeo de la ocupación de la cromatina del factor de transcripción. La adopción generalizada de CUT&RUN está impulsada, en parte, por las ventajas técnicas sobre ChIP-seq convencional que incluyen menores requisitos de entrada de celdas, menores requisitos de profundidad de secuenciación y mayor sensibilidad con una señal de fondo reducida debido a la falta de agentes de reticulación que de otro modo enmascararían los epítopos de anticuerpos. La adopción generalizada de CUT&RUN también se ha logrado gracias al generoso intercambio de reactivos por parte del laboratorio de Henikoff y el desarrollo de kits comerciales para acelerar la adopción por parte de los principiantes. A medida que aumenta la adopción técnica de CUT&RUN, el análisis y la validación de la secuenciación de CUT&RUN se convierten en cuellos de botella críticos que deben superarse para permitir la adopción completa por parte de los equipos de laboratorio predominantemente húmedos. El análisis CUT&RUN suele comenzar con controles de calidad de las lecturas de secuenciación sin procesar para evaluar la profundidad de la secuenciación, la calidad de la lectura y los posibles sesgos. A continuación, las lecturas se alinean con un ensamblaje de secuencia genómica de referencia y, posteriormente, se emplean varias herramientas bioinformáticas para anotar las regiones genómicas del enriquecimiento de proteínas, confirmar la interpretabilidad de los datos y extraer conclusiones biológicas. Aunque se han desarrollado múltiples canales de análisis in silico para soportar el análisis de datos de CUT&RUN, su compleja estructura de múltiples módulos y el uso de múltiples lenguajes de programación hacen que las plataformas sean difíciles para los principiantes en bioinformática que pueden carecer de familiaridad con múltiples lenguajes de programación pero desean comprender el procedimiento de análisis de CUT&RUN y personalizar sus canales de análisis. Aquí, proporcionamos un protocolo de canalización de análisis CUT&RUN paso a paso en un solo idioma, diseñado para usuarios con cualquier nivel de experiencia en bioinformática. Este protocolo incluye la realización de controles de calidad críticos para validar que los datos de secuenciación son adecuados para la interpretación biológica. Esperamos que seguir el protocolo introductorio proporcionado en este artículo, combinado con la anotación de picos aguas abajo, permita a los usuarios extraer información biológica de sus propios conjuntos de datos de CUT&RUN.

Introducción

La capacidad de medir las interacciones entre las proteínas y el ADN genómico es fundamental para comprender la biología de la regulación de la cromatina. Los ensayos eficaces que miden la ocupación de la cromatina para una proteína determinada proporcionan al menos dos datos clave: i) la localización genómica y ii) la abundancia de proteínas en una región genómica determinada. El seguimiento de los cambios en el reclutamiento y la localización de una proteína de interés en la cromatina puede revelar loci diana directa de la proteína y revelar las funciones mecanicistas de esa proteína en los procesos biológicos basados en la cromatin....

Protocolo

NOTA: La información sobre los archivos fastq de CUT&RUN en GSE126612 está disponible en la Tabla 1. La información relacionada con las aplicaciones de software utilizadas en este estudio se enumera en la Tabla de Materiales.

1. Descargar el pipeline de Easy-Shells_CUTnRUN desde su página de Github

1. Abra el terminal desde el sistema operativo.
   NOTA: Si el usuario no está seguro de cómo abrir el terminal en macOS y Windows, revise esta página web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Para Linux, revise esta página web....

Discusión

La capacidad de mapear la ocupación de proteínas en la cromatina es fundamental para realizar estudios mecanicistas en el campo de la biología de la cromatina. A medida que los laboratorios adoptan nuevas técnicas de laboratorio húmedo para perfilar la cromatina, la capacidad de analizar los datos de secuenciación de esos experimentos de laboratorio húmedo se convierte en un cuello de botella común para los científicos de laboratorio húmedo. Por lo tanto, describimos un protoco.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming