ניתוח מבוא ותיקוף של נתוני רצף CUT&RUN

Summary

פרוטוקול זה מנחה ביואינפורמטיקה מתחילים באמצעות צינור ניתוח CUT&RUN מבוא המאפשר למשתמשים להשלים ניתוח ראשוני ואימות של נתוני רצף CUT&RUN. השלמת שלבי הניתוח המתוארים כאן, בשילוב עם ביאור שיא במורד הזרם, תאפשר למשתמשים להסיק תובנות מכניסטיות לגבי ויסות הכרומטין.

Abstract

טכניקת CUT&RUN מאפשרת זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א ברחבי הגנום. יישומים אופייניים של CUT&RUN כוללים שינויי פרופיל בשינויים בזנב היסטון או מיפוי תפוסת כרומטין של גורם שעתוק. אימוץ נרחב של CUT&RUN מונע, בחלקו, על ידי יתרונות טכניים על פני ChIP-seq קונבנציונאלי הכוללים דרישות קלט תאים נמוכות יותר, דרישות עומק ריצוף נמוכות יותר ורגישות מוגברת עם אות רקע מופחת עקב מחסור בחומרים צולבים המסווים אפיטופים של נוגדנים. אימוץ נרחב של CUT&RUN הושג גם באמצעות שיתוף נדיב של ריאגנטים על ידי מעבדת הניקוף ופיתוח ערכות מסחריות להאצת האימוץ למתחילים. ככל שהאימוץ הטכני של CUT&RUN גדל, ניתוח ריצוף CUT&RUN ותיקוף הופכים לצווארי בקבוק קריטיים שיש להתגבר עליהם כדי לאפשר אימוץ מלא על ידי צוותי מעבדה רטובים בעיקר. ניתוח CUT&RUN מתחיל בדרך כלל בבדיקות בקרת איכות על קריאות ריצוף גולמיות כדי להעריך את עומק הרצף, איכות הקריאה והטיות פוטנציאליות. לאחר מכן הקריאות מיושרות להרכבת רצף גנום ייחוס, ולאחר מכן נעשה שימוש במספר כלים ביואינפורמטיים כדי לבאר אזורים גנומיים של העשרת חלבונים, לאשר את יכולת פענוח הנתונים ולהסיק מסקנות ביולוגיות. למרות שצינורות ניתוח מרובים בסיליקו פותחו כדי לתמוך בניתוח נתונים של CUT&RUN, המבנה הרב-מודולי המורכב שלהם והשימוש בשפות תכנות מרובות מקשים על הפלטפורמות למתחילים בתחום הביואינפורמטיקה שאולי חסרים היכרות עם שפות תכנות מרובות אך מעוניינים להבין את הליך הניתוח של CUT&RUN ולהתאים אישית את צינורות הניתוח שלהם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צינור ניתוח CUT&RUN בשפה אחת שלב אחר שלב המיועד למשתמשים עם כל רמה של ניסיון בביואינפורמטיקה. פרוטוקול זה כולל השלמת בדיקות איכות קריטיות כדי לאמת שנתוני הריצוף מתאימים לפענוח ביולוגי. אנו מצפים כי ביצוע פרוטוקול המבוא המסופק במאמר זה בשילוב עם ביאור שיא במורד הזרם יאפשר למשתמשים להסיק תובנות ביולוגיות ממערכי הנתונים שלהם CUT&RUN.

Introduction

היכולת למדוד אינטראקציות בין חלבונים לדנ"א גנומי היא בסיסית להבנת הביולוגיה של ויסות הכרומטין. בדיקות יעילות המודדות את תפוסת הכרומטין עבור חלבון נתון מספקות לפחות שתי פיסות מידע עיקריות: i) לוקליזציה גנומית ו-ii) שפע חלבונים באזור גנומי נתון. מעקב אחר שינויי גיוס ולוקליזציה של חלבון בעל עניין בכרומטין יכול לחשוף מוקדי מטרה ישירים של החלבון ולחשוף תפקידים מכניסטיים של חלבון זה בתהליכים ביולוגיים מבוססי כרומטין, כגון ויסות שעתוק, תיקון DNA או שכפול DNA. הטכניקות הזמינות כיום לפרופיל אינטראקציות חלבון-דנ"א מאפשרות לחוקרים לחקור רגולציה ברזולוציה חסרת תקדים. התקדמות טכנית כזו התאפשרה באמצעות הכנסת טכניקות פרופיל כרומטין חדשות הכוללות פית....

Protocol

הערה: מידע עבור קובצי CUT&RUN fastq ב- GSE126612 זמין בטבלה 1. מידע הקשור ליישומי התוכנה המשמשים במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.

1. הורדת צינור Easy-Shells_CUTnRUN מדף Github שלו

1. מסוף פתוח ממערכת ההפעלה.
   הערה: אם המשתמש אינו בטוח כיצד לפתוח מסוף ב-macOS וב-Windows, עיין בדף אינטרנט זה (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). עבור Linux, עיין בדף אינטרנט זה (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/).
2. הורד את צינור הניתוח הדחוס מ- Github על ידי הקלדת wget https://github.com/JunwooLee89....

תוצאות

איכות וחיתוך המתאם שומרים על קריאות באיכות רצף גבוהה
טכניקות ריצוף בתפוקה גבוהה נוטות ליצור שגיאות ריצוף כגון 'מוטציות' רצף בקריאה. יתר על כן, ניתן להעשיר דימרים של מתאם רצף בערכות נתונים של רצף עקב הסרת מתאם לקויה במהלך הכנת הספרייה. שגיאות ריצוף מוגזמות, כגון.......

Discussion

היכולת למפות את תפוסת החלבונים על הכרומטין היא בסיסית לביצוע מחקרים מכניסטיים בתחום הביולוגיה של הכרומטין. ככל שמעבדות מאמצות טכניקות מעבדה רטובות חדשות לפרופיל כרומטין, היכולת לנתח נתוני ריצוף מאותם ניסויי מעבדה רטובים הופכת לצוואר בקבוק נפוץ עבור מדעני מעבדה רטובה. .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming