CUT&RUN 测序数据的介绍性分析和验证

摘要

该方案指导生物信息学初学者完成入门 CUT&RUN 分析管道，使用户能够完成 CUT&RUN 测序数据的初始分析和验证。完成此处描述的分析步骤，结合下游峰注释，将使用户能够对染色质调控产生机制见解。

摘要

CUT&RUN 技术有助于检测整个基因组中的蛋白质-DNA 相互作用。CUT&RUN 的典型应用包括分析组蛋白尾部修饰的变化或绘制转录因子染色质占有率。CUT&RUN 的广泛采用部分是由于优于传统 ChIP-seq 的技术优势，包括较低的细胞起始量要求、较低的测序深度要求以及由于缺乏掩盖抗体表位的交联剂而提高的灵敏度和降低的背景信号。通过 Henikoff 实验室慷慨分享试剂和开发商业试剂盒以加速初学者的采用，CUT&RUN 也得到了广泛采用。随着 CUT&RUN 技术采用率的增加，CUT&RUN 测序分析和验证成为关键的瓶颈，必须克服这些瓶颈才能让主要湿法实验室团队完全采用。CUT&RUN 分析通常从对原始测序读数的质量控制检查开始，以评估测序深度、读数质量和潜在偏差。然后将读数与参考基因组序列组装进行比对，随后使用多种生物信息学工具来注释蛋白质富集的基因组区域，确认数据可解释性并得出生物学结论。尽管已经开发了多个 计算机 分析管道来支持 CUT&RUN 数据分析，但其复杂的多模块结构和多种编程语言的使用使得这些平台对于可能不熟悉多种编程语言但希望了解 CUT&RUN 分析程序并自定义其分析管道的生物信息学初学者来说变得困难。在这里，我们提供了一个单一语言的分步 CUT&RUN 分析流程方案，专为具有任何生物信息学经验水平的用户而设计。该方案包括完成关键质量检查，以验证测序数据是否适合生物学解释。我们预计，遵循本文提供的介绍性方案与下游峰注释相结合，将允许用户从自己的 CUT&RUN 数据集中获得生物学见解。

引言

测量蛋白质和基因组 DNA 之间相互作用的能力对于理解染色质调控的生物学特性至关重要。测量给定蛋白质的染色质占有率的有效检测至少提供两个关键信息：i） 基因组定位和 ii） 给定基因组区域的蛋白质丰度。追踪染色质中目标蛋白质的募集和定位变化可以揭示蛋白质的直接靶基因座，并揭示该蛋白质在基于染色质的生物过程中的机制作用，例如转录调节、DNA 修复或 DNA 复制。当今可用于分析蛋白质-DNA 相互作用的技术使研究人员能够以前所未有的分辨率探索调节。通过引入新的染色质分析技术，包括 Henikoff 实验室开发靶标下切割和使用核酸酶释放 （CUT&RUN），实现了这种技术进步。与传统的染色质免疫沉淀 （ChIP） 相比，CUT&RUN 具有多项技术优势，包括较低的细胞起始量要求、较低的测序深度要求，以及由于缺乏掩盖抗体表位的交联剂而提高的灵敏度和降低的背景信号。采用这种技术来研究染色质调控需要对该技术的基本原理有透彻的了解，并了解如何分析、验证和解释 CUT&RUN 数据。

CUT&RUN 程序首先将细胞与偶联刀豆球蛋白 A 结合，并与磁珠偶联，以便在整个程序中操纵低细胞数量。使用温和的去污剂对分离的细胞进行透化，以促进引入靶向目标蛋白的抗体。然后使用与酶相连的蛋白 A 或蛋白 A/G 标签将微球菌核酸酶 （MNase） 募集到结合的抗体中。引入钙以启动酶活性。MNase 消化产生单核小体 DNA-蛋白质复合物。....

研究方案

注意： 表 1 中提供了 GSE126612 中 CUT&RUN fastq 文件的信息。与本研究中使用的软件应用程序相关的信息列在 材料表中。

1. 从 Github 页面下载 Easy-Shells_CUTnRUN 管道

1. 从操作系统打开终端。
   注意：如果用户不确定如何在 macOS 和 Windows 中打开终端，请查看此网页 （https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/）。对于 Linux，请查看此网页 （https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/）。
2. 通过在终端中键入 wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip 从 Github 下载压缩的分析管道。
3. 下载 zip 文件后，在终端中键入 unzip ~/Desktop/Easy-She....

讨论

绘制染色质上蛋白质占有率的能力是在染色质生物学领域进行机制研究的基础。随着实验室采用新的湿实验室技术来分析染色质，分析这些湿实验室实验的测序数据的能力成为湿实验室科学家的常见瓶颈。因此，我们描述了一个介绍性的分步协议，使生物信息学初学者能够克服分析瓶颈，并启动对他们自己的 CUT&RUN 测序数据的分析和质量控制检查。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming