Analyse introductive et validation des données de séquençage CUT&RUN

Résumé

Ce protocole guide les débutants en bioinformatique à travers un pipeline d’analyse CUT&RUN d’introduction qui permet aux utilisateurs d’effectuer une analyse initiale et de valider les données de séquençage CUT&RUN. La réalisation des étapes d’analyse décrites ici, combinée à l’annotation des pics en aval, permettra aux utilisateurs de tirer des enseignements mécanistes de la régulation de la chromatine.

Résumé

La technique CUT&RUN facilite la détection des interactions protéine-ADN à travers le génome. Les applications typiques de CUT&RUN comprennent le profilage, les modifications de la queue des histones ou la cartographie de l’occupation de la chromatine par le facteur de transcription. L’adoption généralisée de CUT&RUN est motivée, en partie, par des avantages techniques par rapport au ChIP-seq conventionnel, notamment des exigences d’entrée de cellule plus faibles, des exigences de profondeur de séquençage plus faibles et une sensibilité accrue avec un signal de fond réduit en raison d’un manque d’agents de réticulation qui masquent autrement les épitopes d’anticorps. L’adoption généralisée de CUT&RUN a également été réalisée grâce au partage généreux de réactifs par le laboratoire Henikoff et au développement de kits commerciaux pour accélérer l’adoption par les débutants. À mesure que l’adoption technique de CUT&RUN augmente, l’analyse et la validation du séquençage CUT&RUN deviennent des goulets d’étranglement critiques qui doivent être surmontés pour permettre une adoption complète par des équipes de laboratoire principalement humides. L’analyse CUT&RUN commence généralement par des contrôles de qualité sur les lectures de séquençage brutes afin d’évaluer la profondeur de séquençage, la qualité de lecture et les biais potentiels. Les lectures sont ensuite alignées sur un assemblage de séquence génomique de référence, et plusieurs outils bioinformatiques sont ensuite utilisés pour annoter les régions génomiques d’enrichissement en protéines, confirmer l’interprétabilité des données et tirer des conclusions biologiques. Bien que plusieurs pipelines d’analyse in silico aient été développés pour prendre en charge l’analyse de données CUT&RUN, leur structure multi-modules complexe et l’utilisation de plusieurs langages de programmation rendent les plateformes difficiles pour les débutants en bioinformatique qui peuvent manquer de familiarité avec plusieurs langages de programmation mais souhaitent comprendre la procédure d’analyse CUT&RUN et personnaliser leurs pipelines d’analyse. Ici, nous fournissons un protocole de pipeline d’analyse CUT&RUN étape par étape en langage unique, conçu pour les utilisateurs de tout niveau d’expérience en bioinformatique. Ce protocole comprend la réalisation de contrôles de qualité critiques pour valider que les données de séquençage sont adaptées à l’interprétation biologique. Nous nous attendons à ce que le respect du protocole d’introduction fourni dans cet article, combiné à l’annotation des pics en aval, permette aux utilisateurs de tirer des informations biologiques de leurs propres ensembles de données CUT&RUN.

Introduction

La capacité de mesurer les interactions entre les protéines et l’ADN génomique est fondamentale pour comprendre la biologie de la régulation de la chromatine. Des tests efficaces qui mesurent l’occupation de la chromatine pour une protéine donnée fournissent au moins deux éléments d’information clés : i) la localisation génomique et ii) l’abondance des protéines dans une région génomique donnée. Le suivi des changements de recrutement et de localisation d’une protéine d’intérêt dans la chromatine peut révéler des loci cibles directs de la protéine et révéler les rôles mécanistes de cette protéine dans les processus biologiques basés s....

Protocole

REMARQUE : Les informations sur les fichiers CUT&RUN fastq dans GSE126612 sont disponibles dans le Tableau 1. Les renseignements relatifs aux applications logicielles utilisées dans cette étude sont énumérés dans la Table des matières.

1. Télécharger le pipeline Easy-Shells_CUTnRUN depuis sa page Github

1. Ouvrez le terminal à partir du système d’exploitation.
   REMARQUE : Si l’utilisateur ne sait pas comment ouvrir le terminal sous macOS et Windows, consultez cette page Web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Pour Lin....

Discussion

La capacité de cartographier l’occupation des protéines sur la chromatine est fondamentale pour mener des études mécanistes dans le domaine de la biologie de la chromatine. À mesure que les laboratoires adoptent de nouvelles techniques de laboratoire humide pour profiler la chromatine, la capacité d’analyser les données de séquençage de ces expériences de laboratoire humide devient un goulot d’étranglement courant pour les scientifiques de laboratoire humide. Par conséq.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming