CUT&RUNシーケンシングデータの入門解析と検証

要約

このプロトコルは、バイオインフォマティクスの初心者に、CUT&RUNシーケンシングデータの初期解析とバリデーションを完了するための入門的なCUT&RUN解析パイプラインをガイドします。ここで説明する分析ステップを完了し、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーはクロマチン制御に関するメカニズムの洞察を引き出すことができます。

要約

CUT&RUN技術は、ゲノム全体にわたるタンパク質-DNA相互作用の検出を容易にします。CUT&RUNの代表的なアプリケーションには、ヒストンテール修飾のプロファイリング変更や、転写因子のクロマチン占有率のマッピングなどがあります。CUT&RUNが広く採用されるようになったのは、従来のChIP-seqに比べて、細胞投入量やシーケンシング深度の要件が低いこと、抗体エピトープをマスクする架橋剤がないためにバックグラウンドシグナルが減少することで感度が向上することなど、技術的な利点が一因となっています。また、ヘニコフ研究室による試薬の寛大な共有や、初心者への普及を加速するための市販キットの開発により、CUT&RUNの普及が進んでいます。CUT&RUNの技術的な採用が進むにつれ、CUT&RUNのシーケンシング解析とバリデーションは、主にウェットラボチームによる完全な採用を可能にするために克服しなければならない重大なボトルネックとなっています。CUT&RUN解析は、通常、生のシーケンシングリードの品質管理チェックから始まり、シーケンシングの深さ、リード品質、潜在的なバイアスを評価します。次に、リードをリファレンスゲノム配列アセンブリにアラインメントし、その後、いくつかのバイオインフォマティクスツールを使用して、タンパク質濃縮のゲノム領域にアノテーションを付け、データの解釈可能性を確認し、生物学的結論を導き出します。CUT&RUNデータ解析をサポートするために、複数の in silico 解析パイプラインが開発されていますが、その複雑なマルチモジュール構造や複数のプログラミング言語の使用により、複数のプログラミング言語に精通していないバイオインフォマティクスの初心者にとっては、CUT&RUNの解析手順を理解し、解析パイプラインをカスタマイズしたいと考えている人にとっては、このプラットフォームは困難です。ここでは、バイオインフォマティクスの経験が豊富なユーザー向けに、単一言語のステップバイステップのCUT&RUN解析パイプラインプロトコルを提供します。このプロトコルには、シーケンシングデータが生物学的解釈に適していることを確認するための重要な品質チェックを完了することが含まれます。本稿で紹介した導入プロトコルに従い、ダウンストリームのピークアノテーションと組み合わせることで、ユーザーは自身のCUT&RUNデータセットから生物学的な知見を引き出すことができると期待しています。

概要

タンパク質とゲノムDNAとの間の相互作用を測定する能力は、クロマチン制御の生物学を理解するための基本です。特定のタンパク質のクロマチン占有率を測定する効果的なアッセイは、少なくとも2つの重要な情報を提供します:i)ゲノム局在とii)特定のゲノム領域におけるタンパク質の存在量。クロマチンに関心のあるタンパク質の動員と局在の変化を追跡することで、タンパク質の直接的な標的遺伝子座を明らかにし、転写の調節、DNA修復、DNA複製などのクロマチンベースの生物学的プロセスにおけるそのタンパク質の機構的役割を明らかにすることができます。現在、タンパク質とDNAの相互作用をプロファイリングする技術が利用可能なため、研究者はこれまでにない解像度で制御を探求することができます。このような技術的進歩は、Henikoff研究室によるCleavage Under Targets and Release Using Nuclease(CUT&RUN)の開発を含む新しいクロマチンプロファイリング技術の導入によって可能になりました。CUT&RUNは、従来のクロマチン免疫沈降法 (ChIP) に比べて、細胞投入量が少なく、シーケンシング深度が不十分で、抗体エピトープを隠す架橋剤がないためバックグラウンドシグナルが減少し感度が向上するなど、いくつかの技術的利点があります。この手法をクロマチン制御の研究に採用するには、この手法の根底にある原理を十分に理解し、CUT&RUNデータの解析、検証、解釈の方法....

プロトコル

注意: GSE126612のCUT&RUN高速qファイルに関する情報は 、表1に記載されています。この調査で使用したソフトウェアアプリケーションに関連する情報は、 資料の表に記載されています。

1. GithubページからEasy-Shells_CUTnRUNパイプラインをダウンロードする

1. オペレーティングシステムからターミナルを開きます。
   注意: ユーザーがmacOSおよびWindowsでターミナルを開く方法がわからない場合は、このWebページ(https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/)を確認してください。Linux の場合は、この Web ページ (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/) を確認してください。
2. ターミナルで 「wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip

結果

品質とアダプタートリミングにより、高いシーケンシング品質で読み取りを保持
ハイスループットシーケンシング技術は、リードの配列「変異」などのシーケンシングエラーを生成する傾向があります。さらに、シーケンシングアダプターダイマーは、ライブラリ調製中のアダプター除去が不十分なため、シーケンシングデータセットで濃縮できます.......

ディスカッション

クロマチン上のタンパク質占有率をマッピングする能力は、クロマチン生物学の分野で機構研究を行うための基本です。ラボがクロマチンのプロファイリングに新しいウェットラボ技術を採用するにつれて、ウェットラボ実験からのシーケンシングデータを分析する能力は、ウェットラボの科学者にとって共通のボトルネックになります。そこで、バイオインフォマ.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming