CUT&RUN 염기서열분석 데이터의 입문 분석 및 검증

요약

이 프로토콜은 사용자가 CUT&RUN 염기서열분석 데이터의 초기 분석 및 검증을 완료할 수 있도록 하는 입문용 CUT&RUN 분석 파이프라인을 통해 생물정보학 초보자를 안내합니다. 여기에 설명된 분석 단계를 다운스트림 피크 주석과 함께 완료하면 사용자는 크로마틴 조절에 대한 기계론적 통찰력을 얻을 수 있습니다.

초록

CUT&RUN 기법은 게놈 전반에서 단백질-DNA 상호 작용의 검출을 용이하게 합니다. CUT&RUN의 일반적인 응용 분야에는 히스톤 꼬리 변형의 변화를 프로파일링하거나 전사 인자 크로마틴 점유를 매핑하는 것이 포함됩니다. CUT&RUN의 광범위한 채택은 부분적으로 기존 ChIP-seq에 비해 낮은 세포 입력 요구 사항, 더 낮은 염기서열 분석 깊이 요구 사항, 항체 에피토프를 마스킹하는 가교 결합제의 부족으로 인한 배경 신호 감소로 인한 민감도 증가 등의 기술적 이점에 의해 주도됩니다. CUT&RUN의 광범위한 채택은 Henikoff 실험실의 관대한 시약 공유와 초보자를 위한 채택을 가속화하기 위한 상용 키트 개발을 통해 달성되었습니다. CUT&RUN의 기술 채택이 증가함에 따라 CUT&RUN 염기서열분석 분석 및 검증은 주로 습식 실험실 팀에서 완전히 채택할 수 있도록 극복해야 하는 중요한 병목 현상이 되고 있습니다. CUT&RUN 분석은 일반적으로 염기서열분석 깊이, 판독 품질 및 잠재적 바이어스를 평가하기 위해 원시 염기서열분석 판독에 대한 품질 관리 검사로 시작됩니다. 그런 다음 판독을 참조 게놈 염기서열 어셈블리에 정렬하고, 이후 여러 생물정보학 도구를 사용하여 단백질 농축의 게놈 영역에 주석을 달고, 데이터 해석 가능성을 확인하고, 생물학적 결론을 도출합니다. CUT&RUN 데이터 분석을 지원하기 위해 여러 인실리코(in silico ) 분석 파이프라인이 개발되었지만, 복잡한 다중 모듈 구조와 여러 프로그래밍 언어의 사용으로 인해 여러 프로그래밍 언어에 익숙하지 않을 수 있지만 CUT&RUN 분석 절차를 이해하고 분석 파이프라인을 사용자 정의하려는 생물정보학 초보자에게는 플랫폼이 어렵습니다. 여기에서는 모든 수준의 생물정보학 경험이 있는 사용자를 위해 설계된 단일 언어 단계별 CUT&RUN 분석 파이프라인 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 염기서열분석 데이터가 생물학적 해석에 적합한지 검증하기 위한 중요한 품질 검사를 완료하는 것이 포함됩니다. 이 기사에서 제공하는 소개 프로토콜을 따르면 다운스트림 피크 주석과 함께 사용자가 자신의 CUT&RUN 데이터 세트에서 생물학적 통찰력을 얻을 수 있을 것으로 기대합니다.

서문

단백질과 게놈 DNA 간의 상호 작용을 측정하는 능력은 염색질 조절의 생물학을 이해하는 데 필수적입니다. 주어진 단백질에 대한 염색질 점유율을 측정하는 효과적인 분석은 적어도 두 가지 핵심 정보, 즉 i) 게놈 국소화 및 ii) 주어진 게놈 영역에서의 단백질 풍부도를 제공합니다. 크로마틴에서 관심 있는 단백질의 모집 및 국소화 변화를 추적하면 단백질의 직접적인 표적 위치를 밝히고 전사 조절, DNA 복구 또는 DNA 복제와 같은 크로마틴 기반 생물학적 과정에서 해당 단백질의 기계론적 역할을 밝힐 수 있습니다. 오늘날 단백질-DNA 상호 작용을 프로파일링하는 데 사용할 수 있는 기술을 통해 연구자들은 전례 없는 해상도로 조절을 탐구할 수 있습니다. 이러한 기술적 진보는 Henikoff 실험실의 CUT&RUN(Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) 개발을 포함한 새로운 염색질 프로파일링 기술의 도입을 통해 가능해졌습니다. CUT&RUN은 기존 크로마틴 면역침전(ChIP)에 비해 세포 입력 요구 사항이 낮고, 염기서열 분석 깊이 요구 사항이 낮으며, 항체 에피토프를 마스킹하는 가교 작용제의 부족으로 인한 배경 신호 감소로 감도가 높아지는 등 여러 가지 기술적 이점을 제공합니다. 염색질 ....

프로토콜

참고: CUT&RUN fastq 파일에 대한 정보 files GSE126612 표 1에서 확인할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 소프트웨어 응용 프로그램과 관련된 정보는 자료 표에 나열되어 있습니다.

1. Github 페이지에서 Easy-Shells_CUTnRUN 파이프라인 다운로드

1. 운영 체제에서 터미널을 엽니다.
   참고: 사용자가 macOS 및 Windows에서 터미널을 여는 방법을 잘 모르는 경우 이 웹 페이지(https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/)를 검토하십시오. Linux의 경우 이 웹 페이지(https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/)를 검토하세요.
2. 터미널에 wget https://github.com/JunwooLee89/Easy-Shells_CUTnRUN/archive/refs/heads/main.zip -O ~/Desktop/Easy-Shells_CUTnRUN.zip를 입....

토론

염색질에 대한 단백질 점유율을 매핑하는 능력은 염색질 생물학 분야에서 기계론적 연구를 수행하는 데 기본입니다. 실험실에서 크로마틴을 프로파일링하기 위해 새로운 습식 실험실 기술을 채택함에 따라 이러한 습식 실험실 실험의 염기서열 분석 데이터를 분석하는 능력은 습식 실험실 과학자들에게 일반적인 병목 현상이 되고 있습니다. 따라서 생물정보학 초보자가.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming