CUT&RUN Sıralama Verilerinin Giriş Analizi ve Doğrulanması

Özet

Bu protokol, biyoinformatiğe yeni başlayanlara, kullanıcıların CUT & RUN sıralama verilerinin ilk analizini ve doğrulamasını tamamlamalarını sağlayan giriş niteliğinde bir CUT & RUN analiz hattı aracılığıyla rehberlik eder. Burada açıklanan analiz adımlarının tamamlanması, aşağı akış tepe açıklaması ile birlikte, kullanıcıların kromatin regülasyonu hakkında mekanik içgörüler elde etmesine olanak tanır.

Özet

CUT&RUN tekniği, genom boyunca protein-DNA etkileşimlerinin tespit edilmesini kolaylaştırır. CUT & RUN'ın tipik uygulamaları arasında profil oluşturma, histon kuyruğu modifikasyonlarındaki değişiklikler veya transkripsiyon faktörü kromatin doluluğunun haritalanması yer alır. CUT & RUN'ın yaygın olarak benimsenmesi, kısmen, daha düşük hücre giriş gereksinimleri, daha düşük dizileme derinliği gereksinimleri ve aksi takdirde antikor epitoplarını maskeleyen çapraz bağlama ajanlarının eksikliği nedeniyle azaltılmış arka plan sinyali ile artan hassasiyet içeren geleneksel ChIP-seq'e göre teknik avantajlardan kaynaklanmaktadır. CUT&RUN'ın yaygın olarak benimsenmesi, Henikoff laboratuvarı tarafından reaktiflerin cömert bir şekilde paylaşılması ve yeni başlayanlar için benimsemeyi hızlandırmak için ticari kitlerin geliştirilmesi yoluyla da sağlanmıştır. CUT&RUN'ın teknik olarak benimsenmesi arttıkça, CUT&RUN sıralama analizi ve doğrulaması, ağırlıklı olarak ıslak laboratuvar ekipleri tarafından tam olarak benimsenmesini sağlamak için aşılması gereken kritik darboğazlar haline gelir. CUT&RUN analizi tipik olarak, sıralama derinliğini, okuma kalitesini ve olası sapmaları değerlendirmek için ham sıralama okumaları üzerindeki kalite kontrol kontrolleriyle başlar. Okumalar daha sonra bir referans genom dizisi düzeneğine hizalanır ve daha sonra protein zenginleştirmesinin genomik bölgelerini açıklamak, veri yorumlanabilirliğini doğrulamak ve biyolojik sonuçlar çıkarmak için çeşitli biyoinformatik araçlar kullanılır. CUT & RUN veri analizini desteklemek için birden fazla in silico analiz boru hattı geliştirilmiş olsa da, karmaşık çok modüllü yapıları ve çoklu programlama dillerinin kullanımı, platformları birden fazla programlama diline aşina olmayan ancak CUT & RUN analiz prosedürünü anlamak ve analiz boru hatlarını özelleştirmek isteyen biyoinformatik yeni başlayanlar için zorlaştırmaktadır. Burada, herhangi bir düzeyde biyoinformatik deneyimine sahip kullanıcılar için tasarlanmış tek dilli adım adım bir CUT&RUN analiz boru hattı protokolü sunuyoruz. Bu protokol, sıralama verilerinin biyolojik yorumlama için uygun olduğunu doğrulamak için kritik kalite kontrollerinin tamamlanmasını içerir. Bu makalede sağlanan giriş protokolünü takip etmenin, aşağı akış tepe ek açıklamasıyla birlikte kullanıcıların kendi CUT&RUN veri kümelerinden biyolojik içgörüler elde etmelerine olanak tanıyacağını umuyoruz.

Giriş

Proteinler ve genomik DNA arasındaki etkileşimleri ölçme yeteneği, kromatin regülasyonunun biyolojisini anlamak için temeldir. Belirli bir protein için kromatin doluluğunu ölçen etkili tahliller, en az iki temel bilgi parçası sağlar: i) genomik lokalizasyon ve ii) belirli bir genomik bölgedeki protein bolluğu. Kromatin ile ilgilenen bir proteinin işe alım ve lokalizasyon değişikliklerinin izlenmesi, proteinin doğrudan hedef lokuslarını ortaya çıkarabilir ve bu proteinin transkripsiyonun düzenlenmesi, DNA onarımı veya DNA replikasyonu gibi kromatin bazlı biyolojik süreçlerdeki mekanik rollerini ortaya çıkarabilir. Günümüzde protein-DNA....

Protokol

NOT: CUT&RUN fastq ile ilgili bilgiler GSE126612 Tablo 1'de mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan yazılım uygulamaları ile ilgili bilgiler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Easy-Shells_CUTnRUN pipeline'ı Github sayfasından indirme

1. İşletim sisteminden terminali açın.
   NOT: Kullanıcı macOS ve Windows'ta terminali nasıl açacağından emin değilse, bu web sayfasını (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/) gözden geçirin. Linux için bu web sayfasını (https://www.geeksforgeeks.org/how-to-open-terminal-in-linux/) inceleyin.

Tartışmalar

Kromatin üzerindeki protein doluluğunu haritalama yeteneği, kromatin biyolojisi alanında mekanik çalışmalar yürütmek için esastır. Laboratuvarlar kromatin profili oluşturmak için yeni ıslak laboratuvar tekniklerini benimsedikçe, bu ıslak laboratuvar deneylerinden elde edilen sıralama verilerini analiz etme yeteneği, ıslak laboratuvar bilim adamları için ortak bir darboğaz haline gelir. Bu nedenle, biyoinformatiğe yeni başlayanların analiz darboğazının üstesin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming