Análise Introdutória e Validação de Dados de Sequenciação CUT&RUN

Resumo

Este protocolo orienta os iniciantes em bioinformática através de um pipeline introdutório de análise CUT&RUN que permite aos usuários concluir uma análise inicial e validação dos dados de sequenciamento CUT&RUN. A conclusão das etapas de análise descritas aqui, combinadas com a anotação de pico a jusante, permitirá que os usuários obtenham insights mecanicistas sobre a regulação da cromatina.

Resumo

A técnica CUT&RUN facilita a detecção de interações proteína-DNA em todo o genoma. As aplicações típicas do CUT&RUN incluem alterações de perfil nas modificações da cauda das histonas ou mapeamento da ocupação da cromatina do fator de transcrição. A adoção generalizada do CUT&RUN é impulsionada, em parte, por vantagens técnicas em relação ao ChIP-seq convencional, que incluem requisitos de entrada de células mais baixos, requisitos de profundidade de sequenciamento mais baixos e maior sensibilidade com sinal de fundo reduzido devido à falta de agentes de reticulação que, de outra forma, mascaram os epítopos de anticorpos. A adoção generalizada do CUT&RUN também foi alcançada por meio do compartilhamento generoso de reagentes pelo laboratório Henikoff e do desenvolvimento de kits comerciais para acelerar a adoção para iniciantes. À medida que a adoção técnica do CUT&RUN aumenta, a análise e a validação do sequenciamento CUT&RUN tornam-se gargalos críticos que devem ser superados para permitir a adoção completa por equipes predominantemente de laboratório úmido. A análise CUT&RUN normalmente começa com verificações de controle de qualidade em leituras de sequenciamento bruto para avaliar a profundidade do sequenciamento, a qualidade da leitura e possíveis vieses. As leituras são então alinhadas a uma montagem de sequência do genoma de referência e várias ferramentas de bioinformática são posteriormente empregadas para anotar regiões genômicas de enriquecimento de proteínas, confirmar a interpretabilidade dos dados e tirar conclusões biológicas. Embora vários pipelines de análise in silico tenham sido desenvolvidos para suportar a análise de dados CUT&RUN, sua complexa estrutura de vários módulos e o uso de várias linguagens de programação tornam as plataformas difíceis para iniciantes em bioinformática que podem não ter familiaridade com várias linguagens de programação, mas desejam entender o procedimento de análise CUT&RUN e personalizar seus pipelines de análise. Aqui, fornecemos um protocolo de pipeline de análise CUT&RUN passo a passo de linguagem única, projetado para usuários com qualquer nível de experiência em bioinformática. Este protocolo inclui a conclusão de verificações críticas de qualidade para validar se os dados de sequenciamento são adequados para interpretação biológica. Esperamos que seguir o protocolo introdutório fornecido neste artigo, combinado com a anotação de pico a jusante, permita que os usuários extraiam insights biológicos de seus próprios conjuntos de dados CUT&RUN.

Introdução

A capacidade de medir as interações entre proteínas e DNA genômico é fundamental para entender a biologia da regulação da cromatina. Ensaios eficazes que medem a ocupação da cromatina para uma determinada proteína fornecem pelo menos duas informações importantes: i) localização genômica e ii) abundância de proteínas em uma determinada região genômica. Rastrear as mudanças de recrutamento e localização de uma proteína de interesse na cromatina pode revelar loci alvo direto da proteína e revelar papéis mecanicistas dessa proteína em processos biológicos baseados em cromatina, como regulação da transcrição, reparo do DNA ou replicação do....

Protocolo

NOTA: As informações para os arquivos fastq CUT&RUN em GSE126612 estão disponíveis na Tabela 1. As informações relacionadas aos aplicativos de software utilizados neste estudo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Baixando o pipeline Easy-Shells_CUTnRUN de sua página do Github

1. Abra o terminal do sistema operacional.
   NOTA: Se o usuário não tiver certeza de como abrir o terminal no macOS e no Windows, revise esta página da Web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Para Linux, revise esta página da Web (https://www....

Discussão

A capacidade de mapear a ocupação de proteínas na cromatina é fundamental para a realização de estudos mecanísticos no campo da biologia da cromatina. À medida que os laboratórios adotam novas técnicas de laboratório úmido para traçar o perfil da cromatina, a capacidade de analisar dados de sequenciamento desses experimentos de laboratório úmido torna-se um gargalo comum para cientistas de laboratório úmido. Portanto, descrevemos um protocolo introdutório passo a passo .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming