Analisi introduttiva e convalida dei dati di sequenziamento CUT&RUN

Riepilogo

Questo protocollo guida i principianti della bioinformatica attraverso una pipeline introduttiva di analisi CUT&RUN che consente agli utenti di completare un'analisi iniziale e la convalida dei dati di sequenziamento CUT&RUN. Il completamento delle fasi di analisi qui descritte, in combinazione con l'annotazione dei picchi a valle, consentirà agli utenti di trarre informazioni meccanicistiche sulla regolazione della cromatina.

Abstract

La tecnica CUT&RUN facilita il rilevamento delle interazioni proteina-DNA in tutto il genoma. Le applicazioni tipiche di CUT&RUN includono la profilazione delle modifiche della coda degli istoni o la mappatura dell'occupazione della cromatina del fattore di trascrizione. L'adozione diffusa di CUT&RUN è guidata, in parte, dai vantaggi tecnici rispetto al ChIP-seq convenzionale, che includono minori requisiti di input cellulare, minori requisiti di profondità di sequenziamento e una maggiore sensibilità con un segnale di fondo ridotto a causa della mancanza di agenti reticolanti che altrimenti mascherano gli epitopi anticorpali. L'adozione diffusa di CUT&RUN è stata raggiunta anche attraverso la generosa condivisione di reagenti da parte del laboratorio Henikoff e lo sviluppo di kit commerciali per accelerare l'adozione da parte dei principianti. Con l'aumento dell'adozione tecnica di CUT&RUN, l'analisi e la convalida del sequenziamento CUT&RUN diventano colli di bottiglia critici che devono essere superati per consentire la completa adozione da parte di team di laboratorio prevalentemente umidi. L'analisi CUT&RUN inizia in genere con controlli di qualità sulle letture di sequenziamento grezze per valutare la profondità di sequenziamento, la qualità di lettura e le potenziali distorsioni. Le letture vengono quindi allineate a un assemblaggio di sequenze genomiche di riferimento e successivamente vengono impiegati diversi strumenti bioinformatici per annotare le regioni genomiche dell'arricchimento proteico, confermare l'interpretabilità dei dati e trarre conclusioni biologiche. Sebbene siano state sviluppate più pipeline di analisi in silico per supportare l'analisi dei dati CUT&RUN, la loro complessa struttura multi-modulo e l'utilizzo di più linguaggi di programmazione rendono le piattaforme difficili per i principianti della bioinformatica che potrebbero non avere familiarità con più linguaggi di programmazione ma desiderano comprendere la procedura di analisi CUT&RUN e personalizzare le loro pipeline di analisi. Qui, forniamo un protocollo di pipeline di analisi CUT&RUN passo-passo in un'unica lingua, progettato per utenti con qualsiasi livello di esperienza bioinformatica. Questo protocollo include il completamento di controlli di qualità critici per convalidare che i dati di sequenziamento siano adatti all'interpretazione biologica. Ci aspettiamo che seguire il protocollo introduttivo fornito in questo articolo, combinato con l'annotazione dei picchi a valle, consentirà agli utenti di trarre informazioni biologiche dai propri set di dati CUT&RUN.

Introduzione

La capacità di misurare le interazioni tra proteine e DNA genomico è fondamentale per comprendere la biologia della regolazione della cromatina. I saggi efficaci che misurano l'occupazione della cromatina per una data proteina forniscono almeno due informazioni chiave: i) localizzazione genomica e ii) abbondanza proteica in una data regione genomica. Il monitoraggio dei cambiamenti di reclutamento e localizzazione di una proteina di interesse nella cromatina può rivelare loci bersaglio diretti della proteina e rivelare ruoli meccanicistici di quella proteina nei processi biologici basati sulla cromatina come la regolazione della trasc....

Protocollo

NOTA: Le informazioni per i file fastq CUT&RUN in GSE126612 sono disponibili nella Tabella 1. Le informazioni relative alle applicazioni software utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella dei materiali.

1. Download della pipeline Easy-Shells_CUTnRUN dalla sua pagina Github

1. Aprire il terminale dal sistema operativo.
   NOTA: Se l'utente non è sicuro di come aprire il terminale in macOS e Windows, riview questa pagina web (https://discovery.cs.illinois.edu/guides/System-Setup/terminal/). Per Linux, consulta questa pagina Web (https://w....

Discussione

La capacità di mappare l'occupazione delle proteine sulla cromatina è fondamentale per condurre studi meccanicistici nel campo della biologia della cromatina. Man mano che i laboratori adottano nuove tecniche di laboratorio umido per profilare la cromatina, la capacità di analizzare i dati di sequenziamento di questi esperimenti di laboratorio umido diventa un collo di bottiglia comune per gli scienziati di laboratorio umido. Pertanto, descriviamo un protocollo introduttivo passo-pass.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bedGraphToBigWig	ENCODE	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/	Software to compress and convert readcounts bedGraph to bigWig
bedtools-2.31.1	The Quinlan Lab @ the U. of Utah	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to process bam/bed/bedGraph files
bowtie2 2.5.4	Johns Hopkins University	https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml	Software to build bowtie index and perform alignment
CollectInsertSizeMetrics (Picard)	Broad institute	https://github.com/broadinstitute/picard	Software to perform insert size distribution analysis
Cutadapt	NBIS	https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/index.html	Software to perform adapter trimming
Deeptoolsv3.5.1	Max Planck Institute	https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html	Software to perform Pearson coefficient correlation analysis, Principal component analysis, and Heatmap/average plot analysis
FastQC Version 0.12.0	Babraham Bioinformatics	https://github.com/s-andrews/FastQC	Software to check quality of fastq file
Intervenev0.6.1	Computational Biology & Gene regulation - Mathelier group	https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html	Software to perform venn diagram analysis using peak files
MACSv2.2.9.1	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2	Software to call peaks
MACSv3.0.2	Chan Zuckerberg initiative	https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master	Software to call peaks
Samtools-1.21	Wellcome Sanger Institute	https://github.com/samtools/samtools	Software to process sam/bam files
SEACRv1.3	Howard Hughes Medial institute	https://github.com/FredHutch/SEACR	Software to call peaks
SRA Toolkit Release 3.1.1	NCBI	https://github.com/ncbi/sra-tools	Software to download SRR from GEO
Trim_Galore v0.6.10	Babraham Bioinformatics	https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore	Software to perform quality and atapter trimming