JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نصف طريقة لاستخدام الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) من الفئران من خلال قياس التدفق الخلوي لنقل الخلايا بالتبني. يهدف هذا البروتوكول إلى التحقق من السمية الخلوية المحددة ل TILs ضد الأورام في نموذج فأر سرطان البنكرياس المتزاوي ، مما يوفر رؤى حول تطوير علاجات الخلايا بالتبني لسرطان البنكرياس.

Abstract

سرطان البنكرياس هو ورم خبيث عدواني مع تشخيص كئيب وخيارات علاجية محدودة. يمثل العلاج بالخلايا بالتبني ، والذي يتضمن عزل وتنشيط الخلايا المناعية للمريض ، مثل الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، قبل إعادة حقنها ، نهجا تجريبيا واعدا. ومع ذلك ، فإن تقنيات نقل الخلايا بالتبني في نماذج سرطان البنكرياس قبل السريرية ليست راسخة. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للعلاج بالخلايا بالتبني باستخدام TILs من نموذج فأر سرطان البنكرياس المتزالين. يتضمن الإجراء زرع خلايا سرطان البنكرياس الحية أو المشعة في الفئران المراسلة المسماة بالفلورة لبدء تدفق الخلايا المناعية ، ثم عزل الخلايا الليمفاوية عن الأورام الأولية عن طريق فرز قياس التدفق الخلوي و / أو تنشيط وتوسيع الخلايا التائية التفاعلية للورم خارج الجسم الحي ، ونقل هذه الخلايا التائية المنشطة داخل الصفاق إلى الفئران الحاملة للورم ، متبوعا بإعطاء الإنترلوكين -2. يسمح تصوير الورم المضيء بيولوجيا بالمراقبة الطولية لنمو الورم التقويمي والاستجابة للعلاج ، وخاصة تقييم التأثيرات السامة للخلايا الخاصة بالورم. يلخص هذا النهج الخدمات اللوجستية التي ينطوي عليها تطوير علاجات نقل الخلايا بالتبني لمرضى سرطان البنكرياس. تظهر النتائج فعالية معززة مضادة للأورام للخلايا التائية التفاعلية للورم المنقولة بالتبني مقارنة بضوابط الخلايا الليمفاوية غير ذات الصلة. تتيح هذه المنهجية متعددة الاستخدامات دراسة العلاج المناعي بالتبني في الجسم الحي في سرطان البنكرياس بالإضافة إلى تحسين معلمات معالجة الخلايا وأنظمة العلاج المركبة.

Introduction

العلاج المناعي لسرطان البنكرياس في مراحله الأولى ، مع الاستكشاف والتحقق قبل السريري المستمر بشكل أساسي في نماذج الفئران1. تشمل العلاجات الحالية لسرطان البنكرياس الجراحة والعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والعلاجات الموجهة. لسوء الحظ ، غالبا ما تفشل هذه الطرق في القضاء تماما على آفات الورم ، مما يؤدي إلى التكرار والتطور. تركز العلاجات التقليدية على الخلايا السرطانية ولكنها غالبا ما تتجاهل البيئة المكروية للورم (TME) ، والتي تشمل كلا من الخلايا السرطانية والسدى المرتبط بها المكون من الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) والخلايا الليفية والمصفوفة خارج الخلية2. TILs هي خلايا مناعية داخل TME ، بما في ذلك الخلايا التائية السامة للخلايا ، والخلايا التائية المساعدة ، والخلايا التائية التنظيمية ، والخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والضامة ، والخلايا المثبطة المشتقة من النخاع3. تشارك هذه الخلايا في الاستجابات المناعية التي تؤثر على نمو الورم والنتائج العلاجية4.

يتضمن العلاج بالخلايا بالتبني (ACT) جمع الخلايا المناعية للمريض ، وتعديلها وتوسيعها في المختبر ، ثم إعادة إدخالها لاستهداف الخلايا السرطانية وقتلها. يتم البحث عن علاج TIL ، وهو نوع من ACT ، لعلاج أنواع مختلفة من السرطان ، بما في ذلك سرطان الجلد وسرطان الرئة وسرطان عنق الرحم. تتضمن هذه العملية عزل الخلايا الليمفاوية عن الورم ، وزراعتها باستخدام IL-2 في المختبر ، وإعادة ضخها في المريض ، غالبا بعد استنفاد اللمفاويات بالعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي5.

منذ أن أظهرت دراسة روزنبرغ عام 1986 فعالية TILs في الفئران6 ، أصبح العلاج المناعي لنقل الخلايا بالتبني نقطة ساخنة للبحث وأظهر وعدا في علاج السرطان7،8،9،10. نحن نهدف إلى استخراج TILs من الفئران ، وفرزها لخلايا تائية معينة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، والتحقق من صحة آثارها القاتلة للورم من خلال النقل بالتبني.

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لاستخدام TILs من الفئران من خلال قياس التدفق الخلوي لنقل الخلايا بالتبني. الهدف هو التحقق من السمية الخلوية المحددة ل TILs ضد الأورام في نموذج فأر سرطان البنكرياس المتزابقي ، مما يوفر رؤى حول تطوير العلاجات الخلوية بالتبني لسرطان البنكرياس. تتضمن هذه الطريقة زرع خلايا سرطان البنكرياس الحية أو المشعة في الفئران المراسلة المسماة بالفلورة لبدء تدفق الخلايا المناعية ، وعزل الخلايا الليمفاوية عن الأورام الأولية عن طريق فرز قياس التدفق الخلوي ، أو تنشيط وتوسيع الخلايا التائية التفاعلية للورم خارج الجسم الحي ، ونقل هذه الخلايا التائية المنشطة بالتبني إلى الفئران الحاملة للورم. يسمح الإعطاء اللاحق لتصوير الورم بالإنترلوكين 2 والتصوير الحيوي بالمراقبة الطولية لنمو الورم التقويمي والاستجابة للعلاج ، لا سيما تقييم التأثيرات السامة للخلايا الخاصة بالورم. يلخص هذا النهج الخدمات اللوجستية التي ينطوي عليها تطوير علاجات نقل الخلايا بالتبني لمرضى سرطان البنكرياس. تظهر النتائج فعالية معززة مضادة للأورام للخلايا التائية التفاعلية للورم المنقولة بالتبني مقارنة بضوابط الخلايا الليمفاوية غير ذات الصلة. تتيح هذه المنهجية متعددة الاستخدامات دراسة العلاج المناعي بالتبني في الجسم الحي في سرطان البنكرياس ، بالإضافة إلى تحسين معلمات معالجة الخلايا وأنظمة العلاج المركبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تقع مستعمرة الفئران في منشأة معتمدة من AAALAC International ، وتلتزم بجميع لوائح ومعايير وزارة الزراعة الأمريكية و HHS و NIH ذات الصلة. قام معهد السرطان بجامعة تيانجين الطبية ولجنة رعاية واستخدامها في المستشفى بمراجعة واعتماد جميع الإجراءات الحيوانية ، بما في ذلك الأساس المنطقي لاختيار السلالة ، وتخصيصات المجموعة التجريبية ، والتبرير الإحصائي لأعداد والتوزيع العشوائي.

1. تحريض الورم

  1. استخدم خط خلاياKPC-Luc 11 للحث على أورام البنكرياس التقويمية في الفئران.
  2. قم بإعداد تعليق الخلية عن طريق تربسين خلايا KPC-Luc ، وغسلها مرتين باستخدام PBS ، وإعادة تعليقها بتركيز 1 × 106 خلايا / مل في PBS مع مصفوفة غشاء القاعدي 30٪ (BMM).
  3. قم بتخدير الفأر بالأيزوفلوران بجرعة تحريضية تبلغ 4٪ ثم قم بالتبديل إلى جرعة صيانة بنسبة 2٪. قدم الدعم الحراري باستخدام وسادة التدفئة والمراقبة حسب الضرورة. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف.
  4. قم بتطهير المنطقة الجراحية عدة مرات بحركة دائرية باستخدام مقشر يحتوي على اليود والكحول. قم بإعطاء حقنة تحت الجلد من كاربروفين 5 ملغم / كجم كمسكن قبل الجراحة. باستخدام شفرة مشرط معقمة ، قم بإجراء شق صغير في البطن الأيسر (0.5-1 سم) تحت الضلع الأيسر للفأر لفضح البنكرياس.
  5. استخدم الملقط لتثبيت طحال الفأر وفضح بنكرياس الفأر ، واخلط الخلايا وحقنها في بنكرياس الفأر مع 50,000 خلية لكل فأر. حقن 50 ميكرولتر من معلق الخلية مباشرة في البنكرياس باستخدام إبرة 29 جم.
  6. أعد البنكرياس الفأر وخياطة الصفاق والجلد بالتتابع بالغرز.
  7. اسمح للماوس بالتعافي على وسادة دافئة حتى يستيقظ تماما. يجب تطبيق 5 ملغ/كغ من الكاربروفين تحت الجلد كمسكن بعد الجراحة يوميا لمدة 3 أيام.
  8. إجراء التصوير الحي بعد 7 أيام من الحقن لمراقبة نمو الورم.
    ملاحظة: يمكن إعطاء العلاجات في هذه الخطوة.
    1. حقن الفأر داخل الصفاق بملح البوتاسيوم D-Luciferin (150 ميكروغرام / مل في PBS ، 60 ميكرولتر لكل فأر).
    2. بعد تخدير الأيزوفلوران ، ضع الفأر في نظام التصوير في الجسم الحي للكشف عن التلألؤ البيولوجي. بعد التصوير ، قم بإزالة الماوس من النظام واتركه يتعافى من التخدير بشكل طبيعي.

2. حصاد الأورام

  1. القتل الرحيم للفئران المانحة باستخدام حجرة ثاني أكسيد الكربون2 . تعقيم الجسم كله بنسبة 75٪ من الإيثانول.
  2. ضع الماوس في غطاء معقم. استخدم مقصا وملقطا معقما لفتح تجويف البطن.
  3. قم بإزالة الأورام ووضعها في PBS على الجليد. قم بقياس حجم الورم باستخدام الفرجار الورني واحسب حجم الورم باستخدام الصيغة (π × طول × عرض × عرض) / 6.

3. هضم الورم

  1. تحضير محلول الهضم عن طريق صنع 0.125 مجم / مل كولاجيناز ، و 0.125 مجم / مل Dispase II ، و 10 ميكروغرام / مل DNase I في RPMI 1640 بتركيز 1x. أضف 1-2 مل من محلول الهضم لكل بئر في طبق مكون من 12 بئر.
  2. افرم الأورام إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم. هضم قطع الورم عند 37 درجة مئوية مع رجها عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

4. جمع الخلايا

  1. قم بإنهاء عملية الهضم بإضافة 2-4 مل من مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪. نقل جميع الخلايا إلى أنبوب تجميع.
  2. اغسل الآبار باستخدام PBS مرتين لجمع أي خلايا متبقية. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر أو 70 ميكرومتر.
  3. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 5٪ BSA لتلوين قياس التدفق الخلوي.

5. إعداد قياس التدفق الخلوي

  1. تحضير الطحال أو خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) من الفئران غير الحاملة للورم كضوابط.
    ملاحظة: اختياري: يمكن أيضا استخدام PBMCs من الفئران الحاملة للورم كعناصر تحكم.
  2. الخلايا الملطخة مع حاصرات Fc (<1 ميكروغرام لكل مليون خلية) والأجسام المضادة للتدفق (CD3-APC ، CD45-APC / Fire750 عند تخفيف 1: 100).
  3. احتضن على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. اغسل مرتين باستخدام PBS البارد وأعد تعليق الخلايا في 1٪ BSA في PBS.

6. فرز الخلايا

  1. قم بفرز خلايا CD45 + CD3 + باستخدام مقياس التدفق الخلوي. بوابة الخلايا الحية على أساس FSC-A و SSC-A (P1). بعد ذلك ، قم ببوابة الخلايا المفردة من P1 بناء على FSC-A و FSC-H (P2).
  2. أخيرا ، قم بفرز CD45 + CD3 + من P2 باستخدام بوابات CD45 و CD3 وجمعها في أنابيب التجميع. ضمان إعادة التعليق السليم والحفاظ على صلاحية الخلية أثناء الفرز.

7. تحضير الخلية للنقل

  1. خلايا مفرزة أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في مصل الفأر بتركيز نهائي 1 × 106 خلايا / مل. حافظ على الخلايا على الجليد.
    ملاحظة: يمكن إجراء زراعة خارج الجسم الحي أو تنشيط الخلايا التي تم فرزها.

8. نقل التبني

  1. إجراء تحريض الورم للفأر المتلقي قبل 7 أيام من يوم النقل.
  2. حقن 2 × 105 خلايا لكل فأر داخل الصفاق في الفئران المتلقية باستخدام حقنة الأنسولين 29 جم × 1/2 بوصة. يتم تطبيق IL-2 (50 وحدة دولية لكل فأر) داخل الصفاق لمدة ثلاثة أيام متتالية.

9. مراقبة الورم

  1. قم بإجراء التصوير الحي في اليوم 4 واليوم 7 بعد النقل لتقييم نمو الورم ، مع تصوير حي إضافي أسبوعيا بنفس الإجراء الموضح في الخطوة 1.8.
  2. متابعة بقاء الفئران المتلقية. في نهاية التجربة ، قتل الفأر كما هو موضح أعلاه. استخدم مقص العيون والملقط لإزالة الأورام ، ثم ضعها في PBS على الجليد لقياس سريع لحجم الورم وقد تستمر في التجارب اللاحقة حسب الحاجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تنقسم الفئران المتلقية إلى سبع مجموعات لتقييم فعالية نقل TIL بدقة: (أ) التحكم في المحلول الملحي (تحكم فارغ): تتلقى الفئران حقنا ملحية لتكون بمثابة خط أساس. (ب) IL-2 فقط (تحكم فارغ): الفئران التي تتلقى حقن IL-2 لحساب أي آثار للسيتوكين وحده. (ج) نفس العلاج الفردي للف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قد يعزز العلاج المناعي المحتمل لسرطان البنكرياس جهاز المناعة لاستهداف الخلايا السرطانية والقضاء عليها ، بما في ذلك العلاج المناعي بالتبني ومثبطات نقاط التفتيش المناعية ولقاحات الورم12. يستخرج العلاج TIL الخلايا الليمفاوية ويوسعها من الأورام ، والتي يتم بعد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وأعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح. أثناء استخدام ChatGPT و Claude-3 لتحرير اللغة ، قام المؤلفون بمراجعة الكلمات والجمل التي تم إنشاؤها بواسطة ChatGPT أو Claude-3 بعناية والتحقق من صحتها قبل تضمينها في المقالة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل منح المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC) ، ورقم المنحة 82272767 و 82072691 إلى YM. يشكر المؤلفون أعضاء فريقهم على مناقشتهم وتعاونهم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioluminescent imaging systemPerkinElmerIVIS SpectrumFor monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin VSolarbioA8020For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)JetCSS013040For filtering cell suspensions
CentrifugeEppendorf5810RFor cell collection and preparation
CO2 chamberTianjin LiliangN/AFor euthanizing mice
CollagenaseSigma-AldrichC5138For digestion solution
CD3-APC antibodyBiolegend100236For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibodyBiolegend100154For flow cytometry staining
C57BL/6 albino miceJackson Laboratory58Donor and recipient mice
Dispase IIGibco17105-041For digestion solution
DNase ISparkJadeAC1711For digestion solution
D-Luciferin potassium saltBeyotimeST198-10gFor live imaging
Ethanol (75%)N/AFor sterilization
Fc blockersBD Biosciences553142For flow cytometry staining
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701For cell culture
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria IIIFor cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)PeproTech200-02For administration post-transfer
IsofluraneShandong AnteN/AFor narcotism
KPC-Luc cell linePI lab generatedN/AFor inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel MatrixCorning356234For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)ServicebioG4207-500MLFor washing and resuspending cells
RPMI 1640 mediumGibco11875093For preparing digestion solution
Sterile hoodESCON/AFor sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forcepsN/AFor tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)Jinhuan MedicalR413For wound closure
SyringeJiangxi Fenglin1 mL 0.45 × 16RWLBFor injection
Tissue culture plate 12 wellJetTCP001012For tumor digestion

References

  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved