Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Zusammenfassung

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist eine aggressive bösartige Erkrankung mit einer düsteren Prognose und begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Die adoptive Zelltherapie, bei der patienteneigene Immunzellen, wie z. B. tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), isoliert und aktiviert werden, bevor sie wieder infundiert werden, stellt einen vielversprechenden experimentellen Ansatz dar. Die Techniken für den adoptiven Zelltransfer in präklinischen Pankreaskarzinommodellen sind jedoch nicht gut etabliert. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die adoptive Zelltherapie mit TILs aus einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell. Das Verfahren umfasst die Implantation lebender oder bestrahlter Bauchspeicheldrüsenkrebszellen der Maus in fluoreszenzmarkierte Reportermäuse, um den Einstrom von Immunzellen zu initiieren, dann die Isolierung von Lymphozyten aus Primärtumoren durch Durchflusszytometrie, Sortierung und/oder Aktivierung und Expansion von tumorreaktiven T-Zellen ex vivo und die adoptive intraperitoneale Übertragung dieser aktivierten T-Zellen in tumortragende Mäuse, gefolgt von der Verabreichung von Interleukin-2. Die biolumineszierende Tumorbildgebung ermöglicht die longitudinale Überwachung des orthotopen Tumorwachstums und des Ansprechens auf die Therapie, insbesondere die Bewertung der tumorspezifischen zytotoxischen Wirkungen. Dieser Ansatz rekapituliert die Logistik, die bei der Entwicklung von adoptiven Zelltransfertherapien für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs erforderlich ist. Die Ergebnisse zeigen eine erhöhte Antitumorwirksamkeit von adoptiv übertragenen tumorreaktiven T-Zellen im Vergleich zu irrelevanten Lymphozytenkontrollen. Diese vielseitige Methodik ermöglicht die in vivo-Studie der adoptiven Immuntherapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs sowie die Optimierung von Zellprozessierungsparametern und Kombinationsbehandlungen.

Einleitung

Die Immuntherapie gegen Bauchspeicheldrüsenkrebs befindet sich in der Anfangsphase und wird präklinisch vor allem^{in Mausmodellen} erforscht und validiert 1. Zu den derzeitigen Behandlungen von Bauchspeicheldrüsenkrebs gehören Operationen, Chemotherapien, Strahlentherapien und gezielte Therapien. Leider gelingt es diesen Methoden oft nicht, Tumorläsionen vollständig zu beseitigen, was zu Rezidiven und Progressionen führt. Traditionelle Behandlungen konzentrieren sich auf Tumorzellen, übersehen aber oft die Tumormikroumgebung (TME), die sowohl Tumorzellen als auch das zugehörige Stroma umfasst, das aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs), Fibroblasten und extrazellulärer Matrix besteht². TILs sind Immunzellen innerhalb der TME, einschließlich zytotoxischer T-Zellen, Helfer-T-Zellen, regulatorischer T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen und myeloischer Suppressorzellen³. Diese Zellen sind an Immunantworten beteiligt, die das Tumorwachstum und die therapeutischen Ergebnisse beeinflussen⁴.

Bei der adoptiven Zelltherapie (ACT) werden die Immunzellen eines Patienten gesammelt, in vitro modifiziert und erweitert und dann wieder eingeführt, um Tumorzellen anzugreifen und abzutöten. Die TIL-Therapie, eine Art von ACT, wird zur Behandlung verschiedener Krebsarten erforscht, darunter Melanom, Lungenkrebs und Gebärmutterhalskrebs. Bei diesem Prozess werden Lymphozyten aus dem Tumor isoliert, in vitro mit IL-2 kultiviert und dem Patienten wieder infundiert, oft nach einer Lymphodepletion mit Chemotherapie oder Strahlentherapie⁵.

Seit Rosenbergs Studie aus dem Jahr 1986 die Wirksamkeit von TILs bei Mäusen demonstrierte⁶, hat sich die adoptive Zelltransfer-Immuntherapie zu einem Forschungsschwerpunkt entwickelt und hat sich bei der Krebsbehandlung als vielversprechend erwiesen ^7,8,9,10. Unser Ziel ist es, TILs aus Mäusen zu extrahieren, sie mittels Durchflusszytometrie nach spezifischen T-Zellen zu sortieren und ihre tumortötende Wirkung durch adoptiven Transfer zu validieren.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Verwendung von TILs von Mäusen durch Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer. Ziel ist es, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben. Diese Methode umfasst die Implantation lebender oder bestrahlter Pankreaskrebszellen der Maus in fluoreszenzmarkierte Reportermäuse, um den Einstrom von Immunzellen zu initiieren, die Isolierung von Lymphozyten aus Primärtumoren durch Durchflusszytometrie-Sortierung oder die Aktivierung und Expansion tumorreaktiver T-Zellen ex vivo und die adoptive Übertragung dieser aktivierten T-Zellen in tumortragende Mäuse. Die anschließende Verabreichung von Interleukin-2 und biolumineszierender Tumorbildgebung ermöglicht eine longitudinale Überwachung des orthotopen Tumorwachstums und des Ansprechens auf die Therapie, insbesondere die Bewertung tumorspezifischer zytotoxischer Effekte. Dieser Ansatz rekapituliert die Logistik, die bei der Entwicklung von adoptiven Zelltransfertherapien für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs erforderlich ist. Die Ergebnisse zeigen eine erhöhte Antitumorwirksamkeit von adoptiv übertragenen tumorreaktiven T-Zellen im Vergleich zu irrelevanten Lymphozytenkontrollen. Diese vielseitige Methodik ermöglicht die In-vivo-Studie der adoptiven Immuntherapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs sowie die Optimierung von Zellverarbeitungsparametern und Kombinationsbehandlungen.

Protokoll

Die Mäusekolonie ist in einer von AAALAC International akkreditierten Einrichtung untergebracht, die alle relevanten Vorschriften und Standards von USDA, HHS und NIH einhält. Das Krebsinstitut der Tianjin Medical University und das Hospital Animal Care and Use Committee überprüften und genehmigten alle Tierverfahren, einschließlich der Begründung für die Stammauswahl, der Zuweisung von Versuchsgruppen und der statistischen Begründung für Tierzahlen und Randomisierung.

1. Tumor-Induktion

1. Verwenden Sie die KPC-Luc-Zelllinie¹¹ , um orthotope Pankreastumoren bei Mäusen zu induzieren.
2. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, indem Sie die KPC-Luc-Zellen trypsinisieren, sie zweimal mit PBS waschen und in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml in PBS mit einer 30%igen Basalmembranmatrix (BMM) resuspendieren.
3. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran in einer Induktionsdosis von 4 % und wechseln Sie dann zu einer Erhaltungsdosis von 2 %. Sorgen Sie für eine thermische Unterstützung mit einem Heizkissen und überwachen Sie bei Bedarf. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
4. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mehrmals in kreisenden Bewegungen mit einem Peeling auf Jodbasis und Alkohol. Verabreichen Sie vor der Operation eine subkutane Injektion von Carprofen 5 mg/kg als Analgesie. Führen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge einen kleinen linken Bauchschnitt (0,5-1 cm) unter der linken Rippe der Maus durch, um die Bauchspeicheldrüse freizulegen.
5. Halten Sie die Milz der Maus mit einer Pinzette fest und legen Sie die Bauchspeicheldrüse der Maus frei, mischen Sie Zellen und injizieren Sie sie mit 50.000 Zellen pro Maus in die Bauchspeicheldrüse der Maus. Injizieren Sie 50 μl der Zellsuspension mit einer 29-G-Nadel direkt in die Bauchspeicheldrüse.
6. Bringen Sie die Bauchspeicheldrüse der Maus zurück und vernähen Sie nacheinander das Bauchfell und die Haut mit Nähten.
7. Lassen Sie die Maus auf einem warmen Pad ruhen, bis sie vollständig wach ist. Verabreichen Sie 3 Tage lang täglich 5 mg/kg Carprofen als Analgesie nach der Operation.
8. Führen Sie 7 Tage nach der Injektion eine Live-Bildgebung durch, um das Tumorwachstum zu überwachen.
   HINWEIS: In diesem Schritt können Behandlungen verabreicht werden.
   1. Intraperitoneal injizieren Sie der Maus D-Luciferin-Kaliumsalz (150 μg/ml in PBS, 60 μl pro Maus).
   2. Positionieren Sie die Maus nach der Isofluran-Anästhesie im In-vivo-Bildgebungssystem für den Biolumineszenz-Nachweis. Entfernen Sie die Maus nach der Bildgebung aus dem System und lassen Sie sie sich auf natürliche Weise von der Narkose erholen.

2. Tumore ernten

1. Euthanasieren Sie die Spendermäuse mit einer CO₂ -Kammer. Sterilisieren Sie den ganzen Körper mit 75% Ethanol.
2. Legen Sie die Maus in eine sterile Haube. Verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette, um die Bauchhöhle zu öffnen.
3. Entfernen Sie die Tumore und legen Sie sie in PBS auf Eis. Messen Sie die Tumorgröße mit einem Messschieber und berechnen Sie das Tumorvolumen mit der Formel (π x Länge × Breite × Breite)/6.

3. Tumorverdauung

1. Bereiten Sie die Aufschlusslösung vor, indem Sie 0,125 mg/ml Kollagenase, 0,125 mg/ml Dispase II und 10 μg/ml DNase I in RPMI 1640 als 1x-Konzentration herstellen. Geben Sie 1-2 ml Aufschlusslösung pro Vertiefung in eine 12-Well-Platte.
2. Zerkleinern Sie die Tumore mit einer sterilen Schere in kleine Stücke. Verdauen Sie die Tumorstücke bei 37°C und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei 70 U/min.

4. Entnahme von Zellen

1. Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von 2-4 ml 10% fötalem Rinderserum. Übertragen Sie alle Zellen in ein Sammelröhrchen.
2. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm oder 70 μm Zellsieb.
3. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei 4 °C gesammelt. Resuspendieren Sie die Zellen in 5 % BSA für die Durchflusszytometrie-Färbung.

5. Vorbereitung der Durchflusszytometrie

1. Bereiten Sie Milzzellen oder mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von nicht tumortragenden Mäusen als Kontrollen vor.
   HINWEIS: Optional: PBMCs von tumortragenden Mäusen können auch als Kontrollen verwendet werden.
2. Färbe Zellen mit Fc-Blockern (<1 μg pro Million Zellen) und Flow-Antikörpern (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 in einer Verdünnung von 1:100).
3. 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren. Zweimal mit kaltem PBS waschen und die Zellen in 1% BSA in PBS resuspendieren.

6. Sortierung der Zellen

1. CD45+CD3+ Zellen mit einem Durchflusszytometer sortieren. Gate lebende Zellen auf Basis von FSC-A und SSC-A (P1). Anschließend gaten Sie einzelne Zellen von P1 auf Basis von FSC-A und FSC-H (P2).
2. Zum Schluss sortieren Sie CD45+CD3+ von P2 mit CD45- und CD3-Anschnitt und sammeln sie in den Auffangröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Zelle während der Sortierung ordnungsgemäß resuspendiert und erhalten bleibt.

7. Vorbereitung der Zellen für den Transfer

1. Zentrifugieren Sie sortierte Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die Zellen im Mausserum in einer Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml. Halten Sie die Zellen auf Eis.
   HINWEIS: Eine Ex-vivo-Kultur oder Aktivierung der sortierten Zellen kann durchgeführt werden.

8. Adoptionsübertragung

1. Führen Sie die Tumorinduktion für die Empfängermaus 7 Tage vor dem Transfertag durch.
2. Injizieren Sie 2 x 10⁵ Zellen pro Maus intraperitoneal in Empfängermäuse mit einer 29 G x 1/2" Insulinspritze. IL-2 (50 I.E. pro Maus) intraperitoneal an drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreichen.

9. Tumor-Monitoring

1. Führen Sie an Tag 4 und Tag 7 nach dem Transfer eine Live-Bildgebung durch, um das Tumorwachstum zu beurteilen, mit wöchentlicher zusätzlicher Live-Bildgebung mit dem gleichen Verfahren, das in Schritt 1.8 beschrieben wurde.
2. Verfolgen Sie das Überleben der Empfängermäuse. Am Ende des Experiments euthanasieren Sie die Maus wie oben beschrieben. Verwenden Sie eine Augenschere und eine Pinzette, um die Tumore zu entfernen, und legen Sie sie dann in PBS auf Eis, um eine schnelle Messung der Tumorgröße durchzuführen, und setzen Sie die nachfolgenden Experimente bei Bedarf fort.

Ergebnisse

Die Empfängermäuse werden in sieben Gruppen eingeteilt, um die Wirksamkeit des TIL-Transfers gründlich zu bewerten: (a) Kochsalzlösungskontrolle (Blindkontrolle): Mäuse, die Kochsalzinjekte erhalten, um als Ausgangsbasis zu dienen. (b) Nur IL-2 (Blindkontrolle): Mäuse, die IL-2-Injektionen erhalten, um die Auswirkungen des Zytokins allein zu berücksichtigen. (c) Die gleiche Einzelbehandlung wie bei den behandelten Spendermäusen (Positivkontrolle):...

Diskussion

Potenzielle Immuntherapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs kann das Immunsystem stärken, um Tumorzellen anzugreifen und zu eliminieren, einschließlich adoptiver Immuntherapie, Immun-Checkpoint-Inhibitoren und Tumorimpfstoffen¹². Bei der TIL-Therapie werden Lymphozyten aus Tumoren extrahiert und expandiert, die dann wieder in Patienten infundiert werden. Im Vergleich zu anderen adoptiven Zelltherapien weist die TIL-Therapie eine unterschiedliche TCR-Klonalität, ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion