Aislamiento basado en citometría de flujo y evaluación terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales en un modelo murino de cáncer de páncreas

Resumen

Describimos un método para utilizar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones a través de citometría de flujo para la transferencia de células adoptivas. Este protocolo tiene como objetivo verificar la citotoxicidad específica de los TIL contra tumores en un modelo de ratón de cáncer de páncreas singénico, proporcionando información sobre el desarrollo de terapias celulares adoptivas para el cáncer de páncreas.

Resumen

El cáncer de páncreas es una neoplasia maligna agresiva con un pronóstico sombrío y opciones terapéuticas limitadas. La terapia celular adoptiva, que consiste en aislar y activar las propias células inmunitarias del paciente, como los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), antes de volver a infundirlas, representa un enfoque experimental prometedor. Sin embargo, las técnicas para la transferencia de células adoptivas en modelos preclínicos de cáncer de páncreas no están bien establecidas. Aquí, describimos un protocolo detallado para la terapia celular adoptiva utilizando TILs de un modelo singénico de ratón de cáncer de páncreas. El procedimiento consiste en implantar células de cáncer de páncreas de ratón vivas o irradiadas en ratones reporteros marcados con fluorescencia para iniciar la afluencia de células inmunitarias, luego aislar linfocitos de tumores primarios mediante clasificación por citometría de flujo y/o activar y expandir células T reactivas al tumor ex vivo, y transferir adoptivamente estas células T activadas por vía intraperitoneal a ratones portadores de tumores, seguido de la administración de interleucina-2. Las imágenes tumorales bioluminiscentes permiten el seguimiento longitudinal del crecimiento tumoral ortotópico y la respuesta al tratamiento, especialmente para evaluar los efectos citotóxicos específicos del tumor. Este enfoque recapitula la logística involucrada en el desarrollo de terapias adoptivas de transferencia celular para pacientes con cáncer de páncreas. Los resultados demuestran una mayor eficacia antitumoral de las células T reactivas al tumor transferidas adoptivamente en comparación con los controles de linfocitos irrelevantes. Esta metodología versátil permite el estudio in vivo de la inmunoterapia adoptiva en el cáncer de páncreas, así como la optimización de los parámetros de procesamiento celular y los regímenes de tratamiento combinados.

Introducción

La inmunoterapia contra el cáncer de páncreas se encuentra en sus etapas iniciales, con exploración preclínica en curso y validación principalmente en modelos de ratón¹. Los tratamientos actuales para el cáncer de páncreas incluyen cirugía, quimioterapia, radioterapia y terapias dirigidas. Desafortunadamente, estos métodos a menudo no logran erradicar por completo las lesiones tumorales, lo que lleva a la recurrencia y la progresión. Los tratamientos tradicionales se centran en las células tumorales, pero a menudo pasan por alto el microambiente tumoral (TME), que incluye tanto las células tumorales como el estroma asociado compuesto por linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), fibroblastos y matriz extracelular². Las TIL son células inmunitarias dentro de la TME, incluidas las células T citotóxicas, las células T auxiliares, las células T reguladoras, las células B, las células NK, los macrófagos y las células supresoras derivadas de mieloides³. Estas células participan en respuestas inmunitarias que influyen en el crecimiento tumoral y en los resultados terapéuticos⁴.

La terapia celular adoptiva (ACT, por sus siglas en inglés) consiste en recolectar las células inmunitarias de un paciente, modificarlas y expandirlas in vitro, y luego reintroducirlas para atacar y destruir las células tumorales. La terapia TIL, un tipo de ACT, se está investigando para tratar varios tipos de cáncer, como el melanoma, el cáncer de pulmón y el cáncer de cuello uterino. Este proceso consiste en aislar linfocitos del tumor, cultivarlos con IL-2 in vitro y reinfundirlos en el paciente, a menudo después de la linfodepleción con quimioterapia o radioterapia⁵.

Desde que el estudio de Rosenberg de 1986 demostró la eficacia de los TIL en ratones⁶, la inmunoterapia de transferencia celular adoptiva se ha convertido en un foco de investigación y se ha mostrado prometedora en el tratamiento del cáncer 7,8,9,10. Nuestro objetivo es extraer TILs de ratones, clasificarlos para células T específicas a través de citometría de flujo y validar sus efectos antitumorales a través de la transferencia adoptiva.

En este protocolo, describimos un método para utilizar TILs de ratones a través de citometría de flujo para la transferencia de células adoptivas. El objetivo es verificar la citotoxicidad específica de los TIL contra tumores en un modelo de ratón de cáncer de páncreas singénico, proporcionando información sobre el desarrollo de terapias celulares adoptivas para el cáncer de páncreas. Este método incluye la implantación de células de cáncer de páncreas de ratón vivas o irradiadas en ratones reporteros marcados con fluorescencia para iniciar la afluencia de células inmunitarias, el aislamiento de linfocitos de tumores primarios mediante la clasificación por citometría de flujo, o la activación y expansión de células T reactivas al tumor ex vivo, y la transferencia adoptiva de estas células T activadas a ratones portadores de tumores. La administración posterior de interleucina-2 e imágenes tumorales bioluminiscentes permite el seguimiento longitudinal del crecimiento tumoral ortotópico y la respuesta al tratamiento, en particular para evaluar los efectos citotóxicos específicos del tumor. Este enfoque recapitula la logística involucrada en el desarrollo de terapias adoptivas de transferencia celular para pacientes con cáncer de páncreas. Los resultados demuestran una mayor eficacia antitumoral de las células T reactivas al tumor transferidas adoptivamente en comparación con los controles de linfocitos irrelevantes. Esta metodología versátil permite el estudio in vivo de la inmunoterapia adoptiva en el cáncer de páncreas, así como la optimización de los parámetros de procesamiento celular y los regímenes de tratamiento combinados.

Protocolo

La colonia de ratones se encuentra en una instalación acreditada por AAALAC International, que se adhiere a todas las regulaciones y estándares relevantes del USDA, HHS y NIH. El Instituto de Cáncer de la Universidad Médica de Tianjin y el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital revisaron y aprobaron todos los procedimientos con animales, incluida la justificación de la selección de cepas, las asignaciones de grupos experimentales y la justificación estadística para el número de animales y la aleatorización.

1. Inducción tumoral

1. Utilice la línea celular KPC-Luc¹¹ para inducir tumores pancreáticos ortotópicos en ratones.
2. Preparar una suspensión celular tripsinizando las células KPC-Luc, lavándolas dos veces con PBS y resuspendiéndolas a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL en PBS con una matriz de membrana basal (BMM) del 30%.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano a una dosis de inducción del 4% y luego cambiar a una dosis de mantenimiento del 2%. Proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica y un monitor según sea necesario. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad.
4. Desinfecte el área quirúrgica varias veces con movimientos circulares usando un exfoliante a base de yodo y alcohol. Administrar una inyección subcutánea de carprofeno 5 mg/kg como analgesia antes de la cirugía. Con una hoja de bisturí estéril, realice una pequeña incisión abdominal izquierda (0,5-1 cm) debajo de la costilla izquierda del ratón para exponer el páncreas.
5. Use fórceps para sostener el bazo del ratón y exponer el páncreas del ratón, mezcle las células e inyéctelas en el páncreas del ratón con 50,000 células por ratón. Inyecte 50 μL de la suspensión celular directamente en el páncreas con una aguja de 29 G.
6. Devolver el páncreas de ratón y suturar secuencialmente el peritoneo y la piel con suturas.
7. Deje que el mouse se recupere en una almohadilla tibia hasta que esté completamente despierto. Administrar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea como analgesia después de la cirugía diariamente durante 3 días.
8. Realice imágenes en vivo 7 días después de la inyección para monitorear el crecimiento del tumor.
   NOTA: Los tratamientos pueden administrarse en este paso.
   1. Inyectar intraperitonealmente al ratón sal potásica D-luciferina (150 μg/mL en PBS, 60 μL por ratón).
   2. Después de la anestesia con isoflurano, coloque el ratón en el sistema de imágenes in vivo para la detección de bioluminiscencia. Después de la imagen, retire el ratón del sistema y permita que se recupere de la anestesia de forma natural.

2. Cosecha tumores

1. Eutanasia de los ratones donantes utilizando una cámara de CO₂ . Esterilizar todo el cuerpo con etanol al 75%.
2. Coloque el ratón en una funda estéril. Use tijeras y pinzas estériles para abrir la cavidad abdominal.
3. Extirpe los tumores y colóquelos en PBS sobre hielo. Mida el tamaño del tumor con un calibrador vernier y calcule el volumen del tumor utilizando la fórmula (π x largo × ancho × ancho)/6.

3. Digestión tumoral

1. Prepare la solución de digestión haciendo 0,125 mg/ml de colagenasa, 0,125 mg/ml de dispasa II y 10 ug/ml de DNasa I en RPMI 1640 como concentración de 1x. Agregue 1-2 mL de solución de digestión por pocillo en una placa de 12 pocillos.
2. Pica los tumores en pedazos pequeños con tijeras estériles. Digiera los trozos tumorales a 37 °C agitando a 70 rpm durante 30 minutos.

4. Recolección de células

1. Finalice la digestión añadiendo 2-4 mL de suero bovino fetal al 10%. Transfiera todas las células a un tubo de recolección.
2. Lave los pocillos con PBS dos veces para recoger las células restantes. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm o 70 μm.
3. Recoja las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en BSA al 5 % para la tinción con citometría de flujo.

5. Preparación de la citometría de flujo

1. Preparar células mononucleares de bazo o de sangre periférica (PBMC) de ratones no portadores de tumores como controles.
   NOTA: Opcional: Las PBMC de ratones portadores de tumores también se pueden usar como controles.
2. Tiñir las células con bloqueadores Fc (<1 μg por millón de células) y anticuerpos de flujo (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 en una dilución de 1:100).
3. Incubar en hielo en la oscuridad durante 30 min. Lavar dos veces con PBS frío y resuspender las células en BSA al 1% en PBS.

6. Clasificación de celdas

1. Clasifique las células CD45+CD3+ con un citómetro de flujo. Puerta de células vivas basadas en FSC-A y SSC-A (P1). A continuación, compuerta las células individuales de P1 basadas en FSC-A y FSC-H (P2).
2. Por último, clasifique CD45+CD3+ de P2 utilizando las compuertas CD45 y CD3 y recoja en los tubos colectores. Asegurar la correcta resuspensión y mantenimiento de la viabilidad de la célula durante la clasificación.

7. Preparación de la célula para la transferencia

1. Centrifugar las células clasificadas a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender las células en suero de ratón a una concentración final de 1 x 10⁶ células/mL. Mantén las células en hielo.
   NOTA: Se puede realizar un cultivo ex vivo o la activación de las células clasificadas.

8. Traslado adoptivo

1. Realizar la inducción tumoral del ratón receptor 7 días antes del día de la transferencia.
2. Inyecte 2 x 10⁵ células por ratón por vía intraperitoneal en ratones receptores utilizando una jeringa de insulina de 29 G x 1/2". Administrar IL-2 (50 UI por ratón) por vía intraperitoneal durante tres días consecutivos.

9. Seguimiento tumoral

1. Realice imágenes en vivo el día 4 y el día 7 después de la transferencia para evaluar el crecimiento del tumor, con imágenes en vivo adicionales semanalmente con el mismo procedimiento descrito en el paso 1.8.
2. Hacer un seguimiento de la supervivencia de los ratones receptores. Al final del experimento, eutanasia al ratón como se describió anteriormente. Use tijeras oftálmicas y fórceps para extirpar los tumores, y luego colóquelos en PBS en hielo para una medición rápida del tamaño del tumor y puede continuar con los experimentos posteriores según sea necesario.

Resultados

Los ratones receptores se dividen en siete grupos para evaluar a fondo la eficacia de la transferencia de TIL: (a) Control salino (control en blanco): Ratones que reciben inyecciones de solución salina para que sirvan de referencia. (b) IL-2 solamente (control en blanco): ratones que reciben inyecciones de IL-2 para explicar cualquier efecto de la citocina sola. (c) El mismo tratamiento único que para los ratones donantes tratados (control positivo): Lo...

Discusión

Potencial La inmunoterapia para el cáncer de páncreas puede mejorar el sistema inmunitario para atacar y eliminar las células tumorales, lo que implica inmunoterapia adoptiva, inhibidores de puntos de control inmunitario y vacunas contra tumores¹². La terapia TIL extrae y expande los linfocitos de los tumores, que luego se vuelven a infundir en los pacientes. En comparación con otras terapias celulares adoptivas, la terapia TIL tiene una clonalidad TCR diversa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion