췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

요약

우리는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 검증하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

췌장암은 예후가 좋지 않고 치료 옵션이 제한된 공격적인 악성 종양입니다. 종양 침투 림프구(TIL)와 같은 환자 자신의 면역 세포를 다시 주입하기 전에 분리하고 활성화하는 양자 세포 요법은 유망한 실험적 접근 방식입니다. 그러나 전임상 췌장암 모델에서 양자 세포 전달을 위한 기술은 잘 확립되어 있지 않습니다. 여기에서는 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델의 TIL을 사용한 입양 세포 치료에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 시술은 살아있거나 방사선 조사된 마우스 췌장암 세포를 형광 표지된 리포터 마우스에 이식하여 면역 세포 유입을 시작한 다음, 유세포 분석 분류 및/또는 종양 반응성 T 세포를 생체 외 활성화 및 확장하여 원발성 종양에서 림프구를 분리하고, 이러한 활성화된 T 세포를 복강 내로 종양 보유 마우스에 이식한 다음 인터루킨-2 투여를 수행합니다. 생물발광 종양 이미징을 통해 정형소 종양 성장 및 치료에 대한 반응을 종적으로 모니터링할 수 있으며, 특히 종양 특이적 세포독성 효과를 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식은 췌장암 환자를 위한 입양 세포 전달 요법 개발과 관련된 물류를 요약합니다. 그 결과, 무관한 림프구 대조군에 비해 양양으로 이식된 종양 반응성 T 세포의 향상된 항종양 효능을 입증했습니다. 이 다재다능한 방법론은 췌장암에서 입양 면역 요법에 대한 생체 내 연구뿐만 아니라 세포 처리 매개변수 및 조합 치료 요법의 최적화를 가능하게 합니다.

서문

췌장암 면역요법은 초기 단계에 있으며, 주로 마우스 모델에 대한 전임상 탐구 및 검증이 진행 중입니다¹. 현재 췌장암의 치료법에는 수술, 화학 요법, 방사선 요법 및 표적 요법이 포함됩니다. 불행히도 이러한 방법은 종양 병변을 완전히 근절하지 못하여 재발과 진행으로 이어지는 경우가 많습니다. 전통적인 치료법은 종양 세포에 초점을 맞추지만, 종양 세포와 종양 침윤 림프구(TIL), 섬유아세포 및 세포외 기질²로 구성된 관련 기질을 모두 포함하는 종양 미세환경(TME)을 간과하는 경우가 많습니다. TIL은 세포독성 T세포, 도우미 T세포, 조절 T세포, B세포, NK세포, 대식세포, 골수성 억제세포를 포함하는 TME 내의 면역세포입니다³. 이 세포는 종양의 성장과 치료 결과에 영향을 미치는 면역 반응에 참여합니다⁴.

양자 세포 요법(ACT)은 환자의 면역 세포를 채취하여 체외에서 변형 및 확장한 다음 다시 도입하여 종양 세포를 표적으로 삼고 죽이는 것입니다. ACT의 일종인 TIL 요법은 흑색종, 폐암, 자궁경부암 등 다양한 암을 치료하기 위해 연구되고 있습니다. 이 과정에는 종양에서 림프구를 분리하고, in vitro에서 IL-2로 배양한 다음, 종종 화학요법이나 방사선 요법으로 림프구를 고갈시킨 후 환자에게 재주입하는 것이 포함된다⁵.

Rosenberg의 1986년 연구가 생쥐에서 TIL의 효능을 입증한 이^래6, 양자 세포 전달 면역 요법은 연구 핫스팟이 되었으며 암 치료에서 가능성을 보여주었습니다 ^7,8,9,10. 우리는 마우스에서 TIL을 추출하고, 유세포 분석을 통해 특정 T 세포에 대해 분류하고, 채택 전달을 통해 종양 사멸 효과를 검증하는 것을 목표로 합니다.

이 프로토콜에서는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 TIL을 활용하는 방법을 설명합니다. 목표는 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 확인하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것입니다. 이 방법에는 형광 표지된 리포터 마우스에 살아있거나 방사선 조사된 마우스 췌장암 세포를 이식하여 면역 세포 유입을 시작하거나, 유세포 분석을 통해 원발성 종양에서 림프구를 분리하거나, 생체 외 종양 반응성 T 세포를 활성화 및 확장하고, 이러한 활성화된 T 세포를 종양 보유 마우스로 채택적으로 전달하는 것이 포함됩니다. 이후 인터루킨-2 및 생물발광 종양 영상의 투여를 통해 정형소 종양 성장 및 치료에 대한 반응을 종단적으로 모니터링할 수 있으며, 특히 종양 특이적 세포독성 효과를 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식은 췌장암 환자를 위한 입양 세포 전달 요법 개발과 관련된 물류를 요약합니다. 그 결과, 무관한 림프구 대조군에 비해 양양으로 이식된 종양 반응성 T 세포의 향상된 항종양 효능을 입증했습니다. 이 다재다능한 방법론은 췌장암에서 입양 면역 요법에 대한 생체 내 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 세포 처리 매개변수 및 병용 치료 요법의 최적화를 가능하게 합니다.

프로토콜

생쥐 군집은 AAALAC International 인증 시설에 보관되며 모든 관련 USDA, HHS 및 NIH 규정 및 표준을 준수합니다. 톈진 의과대학 암 연구소(Tianjin Medical University Cancer Institute)와 병원 동물 관리 및 사용 위원회(Hospital Animal Care and Use Committee)는 균주 선택의 근거, 실험 그룹 할당, 동물 수 및 무작위 배정에 대한 통계적 타당성을 포함한 모든 동물 절차를 검토하고 승인했습니다.

1. 종양 유도

1. KPC-Luc 세포주¹¹ 을 사용하여 마우스에서 정소성 췌장 종양을 유도합니다.
2. KPC-Luc 세포를 트립신화하고 PBS로 2회 세척한 후 30% 기저막 매트릭스(BMM)를 사용하여 PBS에서 1 x 10⁶ cells/mL의 농도로 재현탁하여 세포 현탁액을 준비합니다.
3. 4%의 유도 용량으로 이소플루란으로 마우스를 마취한 다음 2%의 유지 용량으로 전환합니다. 필요에 따라 발열 패드와 모니터를 사용하여 열 지원을 제공합니다. 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
4. 요오드 기반 스크럽과 알코올을 모두 사용하여 원을 그리며 수술 부위를 여러 번 소독합니다. 수술 전에 진통제로 카프로펜 5mg/kg을 피하 주사합니다. 멸균 메스 날을 사용하여 마우스의 왼쪽 갈비뼈 아래(0.5-1cm)를 작게 절개하여 췌장을 노출시킵니다.
5. 집게를 사용하여 마우스의 비장을 잡고 마우스의 췌장을 노출시키고 세포를 혼합하여 마우스당 50,000개의 세포가 있는 마우스의 췌장에 주입합니다. 29G 바늘을 사용하여 50μL의 세포 현탁액을 췌장에 직접 주입합니다.
6. 마우스의 췌장을 되돌려 놓고 복막과 피부를 봉합사로 순차적으로 봉합합니다.
7. 마우스가 완전히 깨어날 때까지 따뜻한 패드에서 회복되도록 합니다. 수술 후 3일 동안 매일 5mg/kg의 카프로펜을 진통제로 피하투여합니다.
8. 종양 성장을 모니터링하기 위해 주입 후 7일 후에 실시간 이미징을 수행합니다.
   참고: 이 단계에서 치료를 시행할 수 있습니다.
   1. 마우스에 D-Luciferin 칼륨염(PBS에서 150μg/mL, 마우스당 60μL)을 복강내 주사합니다.
   2. 이소플루란 마취 후 생물 발광 감지를 위해 생체 내 이미징 시스템에 마우스를 배치합니다. 이미징 후 시스템에서 마우스를 제거하고 마취에서 자연스럽게 회복되도록 합니다.

2. 종양 채취

1. CO₂ 챔버를 사용하여 기증자 마우스를 안락사시킵니다. 75% 에탄올로 전신을 살균합니다.
2. 마우스를 멸균 후드에 넣습니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여 복강을 엽니다.
3. 종양을 제거하고 얼음 위의 PBS에 놓습니다. 버니어 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하고 (π x 길이 × 너비 × 너비)/6 공식을 사용하여 종양 부피를 계산합니다.

3. 종양 소화

1. RPMI 1640에서 0.125 mg/ml 콜라겐 분해 효소, 0.125 mg/ml Dispase II 및 10 ug/ml DNase I를 1x 농도로 만들어 분해 용액을 준비합니다. 12웰 플레이트에 웰당 1-2mL의 분해 용액을 추가합니다.
2. 멸균 가위를 사용하여 종양을 작은 조각으로 다집니다. 종양 조각을 37°C에서 70rpm으로 30분 동안 흔들어 소화합니다.

4. 세포 수집

1. 10% 소 태아 혈청 2-4mL를 첨가하여 분해를 종료합니다. 모든 세포를 수집 튜브로 옮깁니다.
2. PBS로 웰을 두 번 세척하여 남아 있는 세포를 수집합니다. 40μm 또는 70μm 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.
3. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 유세포 분석을 위해 세포를 5% BSA에 재현탁합니다.

5. 유세포 분석 준비

1. 비장 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 비종양 마우스의 대조군으로 준비합니다.
   참고: 선택 사항: 종양이 있는 마우스의 PBMC도 대조군으로 사용할 수 있습니다.
2. Fc 차단제(세포 100만 개당 <1μg) 및 유동 항체(CD3-APC, CD45-APC/Fire750, 1:100 희석)로 세포를 염색합니다.
3. 어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 차가운 PBS로 두 번 세척하고 PBS의 1% BSA에 세포를 재현탁합니다.

6. 세포 분류

1. 유세포분석기를 사용하여 CD45+CD3+ 세포를 분류합니다. FSC-A 및 SSC-A(P1)를 기반으로 살아있는 세포를 게이트합니다. 그런 다음 FSC-A 및 FSC-H(P2)를 기반으로 P1에서 단일 세포를 게이트합니다.
2. 마지막으로 CD45 및 CD3 게이팅을 사용하여 P2에서 CD45+CD3+를 분류하고 수집 튜브에 수집합니다. 분류하는 동안 세포 생존력의 적절한 재현탁 및 유지를 보장합니다.

7. 전달을 위한 세포 준비

1. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 분류한 원심분리기. 마우스 혈청의 세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 세포를 얼음 위에 두십시오.
   참고: 분류된 세포의 생체 외 배양 또는 활성화를 수행할 수 있습니다.

8. 입양 전학

1. 이식일 7일 전에 이식 마우스에 대한 종양 유도를 수행합니다.
2. 29 G x 1/2" 인슐린 주사기를 사용하여 마우스당 2 x 10⁵ 세포를 복강내 마우스에 주입합니다. IL-2(마우스당 50IU)를 3일 연속으로 복강내로 투여합니다.

9. 종양 모니터링

1. 이식 후 4일과 7일에 라이브 이미징을 수행하여 종양 성장을 평가하고, 1.8단계에서 설명한 것과 동일한 절차로 매주 추가 라이브 이미징을 수행합니다.
2. 수용 마우스의 생존에 대한 후속 조치. 실험이 끝나면 위에서 설명한 대로 마우스를 안락사시킵니다. 안과 가위와 집게를 사용하여 종양을 제거한 다음 종양 크기를 빠르게 측정하기 위해 얼음 위의 PBS에 넣고 필요에 따라 후속 실험을 계속할 수 있습니다.

결과

수용 마우스는 TIL 전달의 효능을 철저히 평가하기 위해 7개 그룹으로 나뉩니다. (a) 식염수 대조군(블랭크 대조군): 기준선 역할을 하기 위해 식염수 주사를 받는 마우스. (b) IL-2 전용(블랭크 대조군): 사이토카인 단독의 효과를 설명하기 위해 IL-2 주사를 맞은 마우스. (c) 투여된 기증자 마우스와 동일한 단일 처리(양성 대조군): 직접 처리와 TIL 전이?...

토론

췌장암에 대한 잠재적인 면역요법은 양자면역요법, 면역관문억제제, 종양백신과 같은 종양세포를 표적으로 하고 제거하는 면역체계를 강화할 수 있다¹². TIL 요법은 종양에서 림프구를 추출하고 확장한 다음 환자에게 다시 주입합니다. TIL 요법은 다른 양세포치료제와 비교했을 때, 다양한 TCR 클론성, 우수한 종양 유도 능력, 낮은 off-target 독성을 가지고 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum	For monitoring tumor growth
Bovine Serum Albumin V	Solarbio	A8020	For cell resuspension
Cell strainer (40 μm or 70 μm)	Jet	CSS013040	For filtering cell suspensions
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For cell collection and preparation
CO2 chamber	Tianjin Liliang	N/A	For euthanizing mice
Collagenase	Sigma-Aldrich	C5138	For digestion solution
CD3-APC antibody	Biolegend	100236	For flow cytometry staining
CD45-APC/Fire750 antibody	Biolegend	100154	For flow cytometry staining
C57BL/6 albino mice	Jackson Laboratory	58	Donor and recipient mice
Dispase II	Gibco	17105-041	For digestion solution
DNase I	SparkJade	AC1711	For digestion solution
D-Luciferin potassium salt	Beyotime	ST198-10g	For live imaging
Ethanol (75%)		N/A	For sterilization
Fc blockers	BD Biosciences	553142	For flow cytometry staining
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701	For cell culture
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAria III	For cell sorting
IL-2 (Interleukin-2)	PeproTech	200-02	For administration post-transfer
Isoflurane	Shandong Ante	N/A	For narcotism
KPC-Luc cell line	PI lab generated	N/A	For inducing orthotopic pancreatic tumors
Matrigel Matrix	Corning	356234	For orthotopic implantation
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Servicebio	G4207-500ML	For washing and resuspending cells
RPMI 1640 medium	Gibco	11875093	For preparing digestion solution
Sterile hood	ESCO	N/A	For sterile tumor extraction and processing
Sterile scissors and forceps		N/A	For tumor extraction
Suture (4-0, PGA absorbable suture)	Jinhuan Medical	R413	For wound closure
Syringe	Jiangxi Fenglin	1 mL 0.45 × 16RWLB	For injection
Tissue culture plate 12 well	Jet	TCP001012	For tumor digestion